310 10*1 מ"מ צינור מפותל מפלדת אל-חלד רכיב כימי, התחומים ה-N-טרמינליים של ספידרוין יוצרים הידרוג'לים המבוססים על סיבים עמילואידים ומספקים פלטפורמה לקיבוע חלבון.

תודה שביקרת ב-Nature.com.אתה משתמש בגרסת דפדפן עם תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בנוסף, כדי להבטיח תמיכה שוטפת, אנו מציגים את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
סליידרים המציגים שלושה מאמרים בכל שקופית.השתמש בלחצנים 'הקודם' וה'הבא' כדי לעבור בין השקופיות, או בלחצני בקר השקופיות שבקצה כדי לעבור בין כל שקופית.

מִפרָט

310 10*1 מ"מ ספקי צינורות מפותלים מנירוסטה

תרכובת כימית

תכונות מכאניות

לחלבוני משי עכביש רקומביננטיים (חלבוני משי עכביש) יש יישומים פוטנציאליים רבים בפיתוח של חומרים ביולוגיים חדשים, אך טבעם הרב-מודאלי והנוטה לצבירה מקשה על השגה וקל לשימוש.כאן אנו מדווחים שחלבוני ספידרואין מיניאטוריים רקומביננטיים, וחשוב מכך, התחום ה-N-terminal (NT) עצמו יוצרים במהירות הידרוג'לים התומכים בעצמם ושקופים ב-37 מעלות צלזיוס.חלבוני היתוך המורכבים מחלבון NT וחלבון פלואורסצנטי ירוק או פורין נוקלאוזיד פוספורילאז יוצרים חלבוני היתוך מתפקדים במלואם.הידרוג'לים.התוצאות שלנו מראות שחלבוני NT רקומביננטיים וחלבוני היתוך מספקים תשואות ביטוי גבוהות ומעניקים להידרוג'לים תכונות אטרקטיביות כגון שקיפות, ג'לציה ללא הצלבה, וקיבוע ישיר של חלבונים פעילים בצפיפות גבוהה.
לעכבישים יש עד שבעה סטים שונים של בלוטות משי, כל אחד מייצר סוג מסוים של משי.כל שבעת מיני המשי מורכבים מחלבוני משי עכבישים (ספידרוינים) באורך של כ-6000 שאריות ומכילים אזור חוזר מרכזי גדול מוקף בתחומים כדוריים N-ו-C-טרמינליים (NT ו-CT)1,2.סוג המשי הנחקר ביותר, האמפולה הראשונית, מיוצר על ידי בלוטת האמפולה הראשונית.בבלוטה זו, מונו-שכבה של תאי אפיתל מסנתזת חלבוני ספידרואין ומפרישה אותם ללומנם של הבלוטה, שם הם נמצאים בצורה מסיסה (סימום) בריכוזים גבוהים במיוחד (30-50% w/v)3,4.הארגון והקונפורמציה של חלבוני הספידרוין האמפולריים העיקריים בבלוטה נדונו, אך רוב העדויות הניסויות מצביעות על נוכחות של קונפורמציה סלילנית באופן כללי ו/או אקראית ומבנים מיסלריים או למלריים5,6,7,8,9,10.בעוד שהתחומים החוזרים מווסתים תכונות מכניות של סיבי משי, ויוצרים ננו-גבישים של גיליון β ומבנים אמורפיים11,12,13,14,15, תחומי הקצה מווסתים את סיבי המשי בתגובה לתנאים משתנים לאורך בלוטת המשי16,17,18.על ידי שליטה ביצירת המשי, 19. תחומים סופניים נשמרים מבחינה אבולוציונית ותפקודם עשוי להיות משותף לכל חלבוני הספידרוין 2,20,21.במהלך המעבר דרך הבלוטה, ה-pH של הספידרואין יורד מכ-7.6 ל-<5.716 ועולה עם גזירה ומתיחה המתווכת על ידי תנועה דרך הצינור המצטמצם בהדרגה.בתמיסה, CT הוא דימר מקביל מכונן α-סלילי17, אך בתגובה לכוחות pH וגזירה נמוכים, CT נפרש ומחליף שכבות β16, 17, ואולי מפעיל שכבות β באזורים החוזרים על עצמם של Convert 16. NT הם מונומריים מתחת תנאים המשקפים תנאים בלומן של הבלוטה ומתווכים את מסיסותו של ספידרואין, אך ב-pH מופחת, פרוטונציה של מספר שרשראות צד של חומצה קרבוקסילית מובילה לדימריזציה של NT עם pKa של כ-6.5, ובכך מייצבת את ה-NT ומקבעת ספידרואין בגדול. כמיות.רשתות16,18.לפיכך, NT ממלא תפקיד מפתח ביצירת נימה, ומשתנה ממונומר בציפוי לדימר בסיב23,24,25.NT נשאר מסיס מאוד וסלילי בכל התנאים שנחקרו עד היום 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, מה שהיווה השראה לפיתוחה כתווית משפרת מסיסות לייצור חלבונים הטרוגים.
חלבון מיני רקומביננטי משי עכביש, המורכב מ-NT אחד, אזור חזרה קצר אחד, CT אחד ותג His6 (His-NT2RepCT) לטיהור, מסיס במאגר מימי כמו חלבון משי עכביש מקורי ומדמה מאפיינים טבעיים חשובים של עכביש משי. .כיסוי 25.31.ניתן לסובב את His-NT2RepCT לסיבים רציפים באמצעות מכונה ביומימטית שבה ציפוי מסיס pH 8 מוחל לתוך אמבט מים pH 525,32,33,34,35.תסיסה ביו-ריאקטור של E. coli המבטאת His-NT2RepCT ולאחר טיפול לאחר מכן הביאו ליבול של מעל 14 גרם/ליטר לאחר טיהור.התשואה הגבוהה, המסיסות הגבוהה והתגובה המתאימה של His-NT2RepCT לתנאים חומציים מיוחסים כולם ל-NT23, 25, 34.
כאן אנו מדווחים על היווצרות מהירה של הידרוג'לים שקופים מחלבוני ספידרואין רקומביננטיים, כולל NT בלבד, על ידי דגירה של תמיסת חלבון ב-37 מעלות צלזיוס.באמצעות קרינת תיופלבין T (ThT), ספקטרוסקופיה אינפרא אדום של פורייה (FTIR), ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ומיקרוסקופיה אלקטרונית העברה (TEM), מצאנו שחלבוני NT ומיקרו עכביש עוברים טרנספורמציה מבנית ליריעות β וסיבים דמויי עמילואיד. כאשר נוצרים ג'לים.בנוסף, חלבוני היתוך של NT וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או פורין נוקלאוזיד פוספורילאז (PNP) יוצרים הידרוג'לים עם שברי היתוך פונקציונליים לחלוטין.ביטוי בתפוקה גבוהה במארחים הטרוגלים, יחד עם היווצרות מהירה של הידרוג'לים בתנאים פיזיולוגיים, פותח את האפשרות לייצור חסכוני של הידרוג'לים עם פונקציות מהונדסות.
בניגוד לרוב חלבוני הספידרוין הרקומביננטיים המדווחים36, His-NT2RepCT יציב במאגר Tris-HCl ב-pH 8 וניתן לרכז אותו עד 500 מ"ג/מ"ל ללא משקעים25.לכן, הופתענו לגלות שחלבון זה יוצר במהירות הידרוג'לים צלולים אופטית התומכים בעצמם כאשר דגירה ב-37 מעלות צלזיוס (איור 1b-d).מחקרים נוספים הראו כי ג'ל His-NT2RepCT התרחש בטווח רחב של ריכוזי חלבון (10-300 מ"ג/מ"ל) וכי ריכוז זה נמצא בקורלציה הפוכה עם זמן הג'ל (איור 1c ואיור משלים 1).כדי לגלות אילו חלקים של His-NT2RepCT מתווכים יצירת הידרוג'ל, לאחר מכן בדקנו כל תחום בנפרד ובשילובים שונים באמצעות מבחן היפוך בקבוק (איור 1a,b).כל החלקים שנבדקו של ספידרואין רקומביננטי יצרו ג'לים (בריכוז חלבון של 300 מ"ג/מ"ל) תוך פחות משעה אחת, למעט 2Rep המשוקע (איור 1ב).זה מצביע על כך ש-NT ו-CT לבד, בשילוב, או הקשורים לחזרות, יכולים לג'ל ב-37 מעלות צלזיוס ושהתג His6 אינו משפיע על תהליך זה במידה משמעותית.בהתחשב בתפיסה הרווחת ש-NT הוא חלבון מסיס ויציב ביותר, ושדיווחים קודמים על הידרוג'לים של ספידרואין רקומביננטיים ייחסו השפעות ג'ל לשינויים קונפורמטיביים באזורים חוזרים ו/או CTs, NT עצמו יכול היה.גילוי הג'לציה היה בלתי צפוי.טבלה משלימה 1) 37, 38, 39. למרבה הפלא, NT כבר התגבר תוך 10 דקות בריכוז של ≥ 300 מ"ג/מ"ל (איור 1c).ניסויים בהיפוך בקבוקונים עם ריכוזים שונים של NT הראו שבמעלה מ-50 מ"ג/מ"ל תמיסת ה-NT ג'ל מהר יותר מ-His-NT2RepCT בריכוז המתאים (w/v, איור 1c).
ייצוג סכמטי של מבני ספידרואין שונים שנלמדו בעבודה זו.זמן ג'ל ב-37 מעלות צלזיוס עבור חלבוני ספידרואין רקומביננטיים שונים (300 מ"ג/מ"ל) מאומת על ידי היפוך הבקבוקון.ג'ל CT מיד ללא דגירה (<300 מ"ג/מ"ל), משקעים 2Rep (300 מ"ג/מ"ל, קנה מידה של 5 מ"מ).c זמן ג'ל של His-NT2RepCT ו-NT בריכוזי חלבון מצוינים ב-37 מעלות צלזיוס.ד צילומים של הידרוג'לים His-NT2RepCT ו-NT עם העכביש והאות "NT" מודפסים מתחת, בהתאמה (שניהם 200 מ"ג/מ"ל, סרגל קנה מידה 5 מ"מ).
להידרוג'לים שנוצרו על ידי חלבונים רקומביננטיים שונים יש צבעים שונים במקצת, ותצפית בעין בלתי מזוינת מראה דרגות שונות של שקיפות (איור 1b).ג'לי NT ברורים במיוחד בעוד שג'לים אחרים הופכים אטומים.ג'לים שלו-NT2RepCT ו-NT שנוצקים לתוך צינורות גליליים ניתן להסיר מהתבנית שלם (איור 1ד).
כדי לבדוק האם ציפוי משי עכביש טבעי ג'ל בתנאים שנמצאו כעת כגורמים לג'לציה של חלבוני הספידרוין הרקומביננטיים, ציפויים נאספו מבלוטת האמפולה הגדולה של עכביש הגשר השוודי (Larinioides sclopetarius).הציפויים אוחסנו במאגר של 20 מ"מ Tris-HCl ב-50 מ"ג/מ"ל (בהתבסס על משקל יבש שנמדד), אך לא נצפתה ג'לציה במהלך הדגירה של 21 יום ב-37 מעלות צלזיוס (איור משלים 2א).
כדי לכמת ג'לים אלה, ניתן להשתמש במדידות ריאולוגיות כדי ללמוד את תהליך הג'לציה ולקבוע את התכונות המכניות הכוללות.בפרט, ניטור מודול האחסון (גמישות) בטמפרטורות גבוהות יכול לספק מידע על טמפרטורת הג'ל וכן על התכונות הויסקואלסטיות של הציפוי.ניסויי עליית טמפרטורה (באמצעות 1 מעלות צלזיוס לדקה ב-25-45 מעלות צלזיוס, בהתבסס על מחקרים קודמים בשימוש בתמיסות משי טבעיות)40,41 הראו כי מודולי האחסון של פתרונות His-NT2RepCT ו-NT גדלו עם עליית הטמפרטורה.הוגדל (איור 2 ואיור משלים 3).יש לציין, מודול NT התחיל לגדול בטמפרטורה נמוכה יותר בהשוואה ל-His-NT2RepCT, בהתאם לזמן הג'ל המהיר יותר שנצפה כאשר NT הודגרה ישירות עם His-NT2RepCT ב-37 מעלות צלזיוס (איור 1).לאחר ירידה בטמפרטורה לאחר מכן, מודול האחסון לא חזר לערכים נמוכים יותר ונשאר מעל מודול ההפסד (ראה איור משלים 3), מה שמצביע על ג'ל יציב בלתי הפיך תרמית.לאחר הג'לציה, מודול האלסטי הסופי נע בין 15 ל-330 kPa עבור הידרוג'לים His-NT2RepCT בריכוז של 100-500 מ"ג/מ"ל, ומודול האלסטי הסופי עבור הידרוג'לים NT (100-500 מ"ג/מ"ל) נע בין 2 ל-1400 kPa (איור , 2 ונתוני רמפה מלאים) ראה איור משלים 3).
a שינוי בטמפרטורה במהלך מדידות של His-NT2RepCT (300 מ"ג/מ"ל) ו-b NT (300 מ"ג/מ"ל) עם ניעור.החצים מציינים את מגמת הטמפרטורה, וההצללה הבהירה יותר של נתוני מודול האחסון מתארת ​​בדיקה בערכי מומנט נמוכים יותר עבור המכשיר ממה שצוין על ידי היצרן, וזה הגורם לרעש המוגבר.c הצטברות מודול קצה של His-NT2RepCT ו-NT לאחר טמפרטורה גבוהה (100, 300 ו-500 מ"ג/מ"ל).כל קריאות המודול נלקחות בתדר של 0.1 הרץ.
כשיטה פוטנציאלית לחקירת שינויים קונפורמטיביים הקשורים לג'לציה, תיעדנו ספקטרום FTIR של His-NT2RepCT ו-NT לפני ואחרי ג'לציה ב-37 מעלות צלזיוס (איור 3a,b).כצפוי, הספקטרום של תמיסות His-NT2RepCT ו-NT תואמות לחלבונים המראים מבנה משני של α-helix/סליל אקראי, עם פס בולט ב-1645 cm-1.עבור שני ההידרוג'לים, ג'לציה הובילה להיווצרות של שתי זרועות ברצועת ה-I האמצעית ב-1617 ס"מ-1 ו-1695 ס"מ-1 בערך (איור 3a, b), מה שמצביע על היווצרות של מבני β-sheet אנטי מקבילים.ניתן לראות שינויים אלה בבירור גם בנגזרת השנייה ובספקטרום הג'לציה ההבדל (איור משלים. 4b).שתי הרצועות של שכבת NT β היו בולטים יותר מאלו של His-NT2RepCT, מה שמצביע על כך שהתכולה הכוללת של רצועות שכבת β בהידרוג'ל NT הייתה גבוהה מזו של ההידרוג'ל NT2RepCT.
ספקטרום ספיגת FTIR של His-NT2RepCT ו-b NT (שניהם 500 מ"ג/מ"ל) לפני (תמיסה) ואחרי (ג'ל) דגירה ב-37 מעלות צלזיוס.ג תמונות TEM של 50 מ"ג/מ"ל NT2RepCT ג'לים מורחקים ו-d NT.סרגל קנה מידה 200 ננומטר.קוטרי סיבים של His-NT2RepCT ו-NT הידרוג'לים.n = 100 פיברילים שנמדדו, p < 0.0001.פסי השגיאה מציגים את סטיית התקן.מרכז פסי השגיאה הוא הממוצע.לניתוח סטטיסטי נעשה שימוש במבחן t לא מזווג (דו-זנבתי).f פלואורסצנטי ThT של חלבוני ספידרוין רקומביננטיים שונים (100 מ"ג/מ"ל) ב-37 מעלות צלזיוס ללא רעד.ניסויי חיסון של g NT (100 מ"ג/מ"ל) מ-100 מ"ג/מ"ל ג'ל NT עם 0%, 5%, 10% ו-20% זרעים.
ניתוח הג'ל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים העברה (TEM) הראה כי ההידרוג'ל מורכב מסיבים דמויי עמילואיד (איורים 3c, 3d).סיבים שנוצרו ב-NT היו מוארכים (5-12 ננומטר בקוטר) ולא מסועפים, בעוד שסיבי His-NT2RepCT היו קצרים יותר באורך וקוטר רחב יותר באופן משמעותי (7-16 ננומטר) (איור 3e).תוצאות אלו אפשרו לנו לעקוב אחר הקינטיקה של פיברוזיס באמצעות מבחן thioflavin T (ThT).עבור כל חלבוני הספידרוין הרקומביננטיים, האות הפלורסנטי גדל כאשר הדגימות הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס (איור 3f, איור משלים. 5a).בהתאם לממצא זה, בדיקה מיקרוסקופית של NT ו-His-NT2RepCT בתנאי ג'ל גילתה עלייה אחידה בקרינת ThT ללא הצטברות מקומית ניכרת של אגרגטים חיוביים ל-ThT (איור משלים. 5b,c).היווצרות של סיבים חיוביים ל-ThT לא לוותה בעלייה בעכירות NT ו-His-NTCT (איור משלים 5d), מה שאומר שיכולה להיווצר רשת של סיבים בג'ל מבלי לפגוע בבהירות הג'ל.זריעה על ידי הוספת כמויות קטנות של סיבים שנוצרו מראש יכולה להאיץ באופן משמעותי את היווצרות סיבים של כמה עמילואידים42,43,44 אך הוספת 5%, 10% או 20% (w/w) NT לתמיסה של NT hydrocoagulants.אפקט זריעה (איור 3g).אולי זה נובע מהעובדה שהסיביים בהידרוג'ל קבועים יחסית ואינם יכולים לשמש כזרעים.
ההתנהגות הבלתי צפויה של חלבוני ספידרואין רקומביננטיים בטמפרטורות גבוהות גרמה למחקרי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) נוספים כדי לזהות שינויים קונפורמטיביים הקשורים להיווצרות ג'ל.ספקטרום NMR של פתרונות His-NT2RepCT שתועדו לאורך זמן ב-37 מעלות צלזיוס הראו ש-CT עדיין מקופל חלקית, בעוד שאותות NT ו-2Rep נעלמו (איור 4a), מה שמצביע על כך שדווקא NT ו-2Rep הם ששלטו חלקית בהיווצרות His- הידרוג'ל NT2RepCT.אות ה-CT הוחלש גם הוא ל-20% מהעוצמה המקורית שלו, מה שמצביע על כך שגם ה-CT מקובע בעיקר ומשולב במבנה ההידרוג'ל.עבור חלק קטן יותר של ה-CT, שהוא נייד כמו בדגימה המוקדמת ובכך נצפה על ידי NMR של תמיסה, בספקטרום חסרים אותות עבור 10 השרידים המובנים הראשונים, אולי בגלל אימוביליזציה קשה של החלק המצורף של His-NT2Rep.ספקטרום ה-NMR של מצב ההידרוג'לים -NT2RepCT חשף את הנוכחות השלטת של סלילי α ושכבות β, ובמידה פחותה, מבנה הסליל האקראי (איור 4b).ניתוח היסט כימי של שאריות מתיונין הקיימות רק ב-NT הראה שתחום זה הומר למבנה β-sheet.הספקטרום התלוי בזמן של NT בתמיסה הראה ירידה אחידה בעוצמת האות (איור 4c), ו-NMR במצב מוצק של NT הידרוג'לים הראה שרוב שאריות ה-NT הומרו למבני β-sheet (איור 4d).לא ניתן היה לקבוע את הקונפורמציה של 2Rep בנפרד עקב נטייתו להצטבר.עם זאת, ספקטרום ה-NMR במצב מוצק של ההידרוג'לים NTCT ו-His-NT2RepCT נראו דומים מאוד (איור 4b; איור משלים 6b), מה שמצביע על כך ש-2Rep תרם מעט לחלק המבני של ההידרוג'ל His-NT2RepCT.עבור CT הידרוג'לים, נמצאו α-helices, β-sheets ומבנים משניים סליליים אקראיים (איור משלים. 6d).זה מצביע על כך שחלקים מסוימים של ה-CT נשארים α-helices בעוד שאחרים הופכים ל-β-sheets.לפיכך, התוצאות של ספקטרוסקופיה של NMR מצביעות על כך ש-NT חשוב ליצירת הידרוג'ל וגם הופך לקונפורמציה של β-sheet עם היתוך עם 2Rep ו-CT.בהתאם לכך, לאחרונה מצאנו כי רוכסנים מרחביים עמילואידים נוצרים ככל הנראה בכל חמשת הסלילים של תחום ה-NT, ואלגוריתם Waltz חזה אזור עמילואידגני בסליל 1 (איור 4ה).
ספקטרום דו-ממדי של 15N-HSQC 10 מ"ג/מ"ל תמיסת His-NT2RepCT לפני (כחול) ו-19 שעות לאחר הדגירה (אדום) ב-37 מעלות צלזיוס.פסגות צולבות בודדות בספקטרום האדום ו-F24, G136, polyA בספקטרום הכחול מסומנים על ידי סמלי חומצות אמינו באותיות בודדות ומספרי שיירים.ההוספות מציגות את התלות של עוצמת האות בזמן עבור שאריות נבחרות מתחומי NT, 2Rep ו-CT.b ספקטרום תדר רדיו במצב מוצק (RFDR) של הידרוג'לים His-NT2RepCT.מתאמים של שיירי Cα/Cβ שנצפו בספקטרום RFDR נקבעו על ידי השוואה עם שינויים כימיים וערכים של מודל פפטידים שנגזרו מסטטיסטיקה82,83 והמבנים המשניים שלהם.SSB – פס צד מסתובב.ג ספקטרום חד מימדי של תמיסת NT 15N-HSQC 10 מ"ג/מ"ל במהלך דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 36 שעות.התוספת מציגה עוצמה נפחית לעומת זמן.ד ספקטרום RFDR במצב מוצק של הידרוג'לים NT.הקורלציות של שיירי Cα/Cβ והמבנים המשניים שלהם שנצפו בספקטרום RFDR מצוינים.ה מבוסס על פרופיל הנטייה לפרפור NT45.79 ממסד הנתונים Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).אנרגיית הרוזטה של ​​חלון משמרת הברק המרחבית של ההקספפטיד מוצגת בקקל/מול.פסים אדומים מציינים הקספפטידים בעלי נטייה גבוהה לפיברוזיס (אנרגיית רוזטה מתחת ל-23 קק"ל/מול; מתחת לקו המקווקו).פסים ירוקים מציינים שברים עם אנרגיות רוזטה מעל הסף ולכן פחות סיכוי ליצור רוכסנים סטריים.שברים המכילים פרולין לא נכללו בניתוח (ללא עמודות).ריבועים מציינים אזורים של עמילואידוזיס שנחזה על ידי אלגוריתם Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).רצף שיירי חומצות האמינו של NT נמצא בחלק העליון, וסוגי השיירים המצויים במבנה המשני β (נקבע על ידי ספקטרוסקופיה של NMR במצב מוצק) מוצגים באדום.המיקומים של חמשת סלילי NT מסומנים כ-(H1-H5)28.
ב-pH <6.5, HT מתעמעם, בהיותו עמיד לדנטורציה הנגרמת על ידי חום או אוריאה18.כדי להבהיר כיצד דימריזציה ויציבות NT משפיעים על הג'ל, תמיסות המכילות 100 מ"ג/מ"ל NT נשלטו ב-pH 8, 7 ו-6 באמצעות בדיקת היפוך הבקבוקון.דגימות NT שהודגרו ב-pH 8 ו-7 ג'ל לאחר 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, אך הג'ל של pH 8 נשאר צלול, בעוד שהג'ל של pH 7 הראה משקע גלוי (איור 5א).לעומת זאת, תמיסה המכילה HT ב-pH 6 לא יצרה ג'ל, וניתן היה לראות משקע גדול לאחר 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.זה מצביע על כך שהדימרים עצמם ו/או היציבות הגבוהה יותר שלהם בהשוואה למונומרים מונעים ג'לציה.היווצרות משקע ל-NT ב-pH 7 ו-6 לא הייתה צפויה, מכיוון שדווח כי NT מסיס ב-200 מ"ג/מ"ל27, מתקפל מחדש בקלות לאחר דנטורציה בחום, וגם שומר על α-helix בערכים נמוכים יותר של pH 18. הסבר סביר לפערים אלו הוא שהניסויים שדווחו בעבר בוצעו בטמפרטורת החדר או מתחת, או בריכוזי חלבון נמוכים יחסית16,18,19.
בדיקת היפוך בקבוקון NT (100 מ"ג/מ"ל) ב-pH 8, 7, 6 ו-154 mM NaCl (pH 8) לאחר דגירה ב-37°C.b NT CD ספקטרום עם ובלי 154 mM NaF ו-154 mM NaCl, בהתאמה.אליפטיות טוחנת ב-222 ננומטר מומרת לשיעור של קפלים טבעיים.c בדיקת היפוך NT (100 מ"ג/מ"ל) NT* (37 מעלות צלזיוס ו-60 מעלות צלזיוס), NTA72R (37 מעלות צלזיוס) ו-His-NT-L6 (37 מעלות צלזיוס ו-60 מעלות צלזיוס).d ספקטרום CD של מוטציות NT NT*, NTA72R ו-His-NT-L6.אליפטיות טוחנת ב-222 ננומטר מומרת לשיעור של קפלים טבעיים.e בדיקת היפוך של NTFlSp, NTMiSp ו-NTMiSp מופחת (100 מ"ג/מ"ל).סרגל קנה מידה 5 מ"מ.f CD ספקטרום של NT, NTFlSp, NTMiSp ו-NTMiSp מופחת.אליפטיות טוחנת ב-222 ננומטר מומרת לשיעור של קפלים טבעיים.ספקטרום מלא של NT ב-25 מעלות צלזיוס ו-95 מעלות צלזיוס מוצגות באיור משלים 8.
ריכוז המלחים הפיזיולוגי קובע אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין תת-יחידות NT ודימריזציה של העברת NT ל-pH18 נמוך יותר.מצאנו שהנוכחות של 154 mM NaCl ו-NaF אכן עיכבה ג'לציה, בהתאמה (איור 5a, b; איור משלים 2b) וכי מלחים אלו הגבירו את היציבות התרמית של מונומרים NT (איור 5b, איור משלים 8). .זה גם מצביע על כך ששיפור היציבות, במקום דימריזציה, מונע היווצרות ג'ל.
כדי להמשיך ולחקור את התפקיד של דימריזציה ויציבות חלבון בג'לציה, השתמשנו בשני מוטנטים, NT* ו-NTA72R, שגם נשארים מונומריים ב-pH נמוך של 28.30.NT* הוא מוטנט להיפוך מטען כפול שבו חלוקת המטען הדו-קוטבית לכאורה של המונומר משטחת, מה שמונע דימריזציה ומגביר באופן דרסטי את יציבות המונומר.NTA72R הוא דיפול טעון, אך Ala המוחלף ב-Arg ממוקם בגבול הדימר, כך שמוטציות מפריעות לאינטראקציות של תת-יחידות הנדרשות לדימריזציה.עם דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, NT* לא יצר הידרוג'ל, בעוד NTA72R יצר ג'ל אטום למשך 15 דקות (איור 5c).מכיוון שגם NT* וגם NTA72R אינם יכולים להתבלבל אך שונים ביציבות המונומר (איור 5d), תוצאות אלו מצביעות על כך שיציבות תרמודינמית גבוהה מונעת מ-NT להיווצר ג'ל.הדבר נתמך גם על ידי העובדה ש-HT* יוצר ג'ל כשהוא לא יציב בטמפרטורה גבוהה (לאחר 8 דקות ב-60°C; איור 5c).הוכח בעבר שהתכולה הגבוהה של מתיונין ב-NT מנזלת את הקיפול הטבעי שלו ושישה תחליפי Met to Leu (המכונים כאן His-NT-L6) מייצבים מאוד את המונומר NT46.בהתבסס על ההנחה שנדרשת גמישות מבנית ליצירת ג'ל NT, מצאנו שהמוטנט היציב His-NT-L6 לא ג'ל ב-37 מעלות צלזיוס (איור 5c, ד).עם זאת, His-NT-L6 גם יצר ג'ל עם דגירה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות (איור 5c).
נראה שהיכולת של NT להפוך למבני β-sheet וליצור הידרוג'לים חלה על חלק אך לא על כל תחומי ה-NT של ספידרואין.NTs מסוגי משי וממיני עכבישים שונים, Trichonephila clavipes (NTFlSp), יצרו ג'לים למרות תכולת המתיונין הנמוכה יחסית והיציבות התרמית הגבוהה שלהם (איור 5e, F וטבלה משלימה 2).לעומת זאת, NT מהחלבון האמפולרי הקטן spidroin מ-Araneus ventricosus (NTMiSp) עם יציבות תרמית נמוכה ותכולת מתיונין גבוהה לא יצר הידרוג'לים (טבלה משלימה 2 ואיור 5e, f).זה האחרון עשוי להיות קשור לנוכחות של קשרי דיסולפיד תוך-מולקולריים29,47.באופן עקבי, כאשר קשרי הדיסולפיד של NTMiSp הופחתו, הוא יצר הידרוג'ל לאחר דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (איור 5ה).לסיכום, יש לציין כי גמישות מבנית היא קריטריון חשוב, אך לא היחיד, ליצירת ג'ל מ-NT.גורם נוסף שעשוי להיות רלוונטי הוא הנטייה ליצור סיבים עמילואידים, וניתוח עם מסד הנתונים הרוכסן ואלגוריתם Waltz אכן הראה מתאם בין היכולת ליצור ג'לים לבין נוכחותם של אזורים עמילואידגנים, כמו גם היקף האזורים החזויים ליצירת רוכסנים סטריים.היה מתאם (טבלה משלימה 2 ואיור משלים 9).
היכולת של NT ליצור סיבים וליצור ג'לים בתנאים נוחים הובילה אותנו לשער שהיתוך NT עם שברי חלבון אחרים עדיין יכולים ליצור ג'לים עם תפקוד מלא של שותפים לאיחוי.כדי לבדוק זאת, הצגנו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ופורין נוקלאוזיד פוספורילאז (PNP) בקצה ה-C של ה-NT, בהתאמה.חלבוני ההיתוך שהתקבלו באו לידי ביטוי ב-E. coli עם תפוקות סופיות גבוהות מאוד (150 מ"ג/ליטר ו-256 מ"ג/ליטר תרביות בקבוק ניעור עבור His-NT-GFP ו-His-NT-PNP, בהתאמה), בהתאם למה שהוכח. עבור חלבונים אחרים שהתמזגו ל-NT Ref.30. חלבוני היתוך His-NT-GFP (300mg/mL) ו-His-NT-PNP (100mg/mL) יצרו ג'לים לאחר שעתיים ו-6.5 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, וחשוב מכך, חלק ה-GFP נותר ללא שינוי.נצפה לאחר ג'לציה, כאשר יותר מ-70% מעוצמת הקרינה הראשונית נותרה לאחר הג'לציה (איור 6א).כדי למדוד פעילות PNP בתמיסות ובג'לים שלו-NT-PNP, היינו צריכים לדלל את חלבון ההיתוך עם NT מכיוון שהפעילות האנזימטית של התכשיר הטהור הייתה מחוץ לטווח הזיהוי של המבחן בריכוזי ג'ל.הג'ל שנוצר עם תערובת המכילה 0.01 מ"ג/מ"ל His-NT-PNP ו-100 מ"ג/מ"ל NT שמר על 65% מהפעילות האנזימטית הראשונית של הדגימות המוקדמות (איור 6ב).הג'ל נשאר שלם במהלך המדידה (איור משלים 10).
עוצמת הקרינה היחסית לפני ואחרי ג'ל של His-NT-GFP (300 מ"ג/מ"ל) ובקבוקון הפוך המכיל הידרוג'ל His-NT-GFP (300 מ"ג/מ"ל) תחת אור גלוי ו-UV.נקודות מציגות מדידות בודדות (n=3), פסי שגיאה מראים סטיית תקן.הערך הממוצע מוצג במרכז פסי השגיאה.b פעילות PNP הושגה על ידי ניתוח פלואומטרי באמצעות תמיסות וג'לים המורכבים מ-NT (100 מ"ג/מ"ל) ותערובת המכילה 0.01 מ"ג/מ"ל his-NT-PNP ו-100 מ"ג/מ"ל דולר טייוואן חדש.התוספת מציגה בקבוקון הפוך המכיל הידרוג'ל המכיל His-NT-PNP (סרגל בקנה מידה 5 מ"מ).
כאן, אנו מדווחים על היווצרות הידרוג'לים מ-NT וחלבוני ספידרואין רקומביננטיים אחרים על ידי דגירה של תמיסת חלבון ב-37 מעלות צלזיוס (איור 1).אנו מראים כי ג'לציה קשורה להפיכת סלילי α לשכבות β וליצירת סיבים דמויי עמילואיד (איורים 3 ו-4).ממצא זה מפתיע שכן NTs הם צרורות כדוריות מפותלות של חמישה סליל הידועים במסיסות הגבוהה ביותר וביציבות הגבוהה שלהם בריכוזים מעל 200 מ"ג/מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים27.בנוסף, NTs מתקפלים מחדש בקלות לאחר דנטורציה בחום בריכוזי חלבון נמוכים במיקרומטר.על פי התוצאות שלנו, היווצרות סיבים דורשת שילוב של ריכוז חלבון מעל 10 מ"ג/מ"ל וטמפרטורה מוגברת מעט (איור 1).זה עולה בקנה אחד עם הרעיון שספירלי עמילואיד יכולים להיווצר מחלבונים מקופלים כדורית שנמצאים במצב לא מקופל חלקית עקב תנודות תרמיות בתנאים פיזיולוגיים 48 .דוגמאות לחלבונים שעוברים המרה זו כוללות אינסולין49,50, β2-microglobulin, טרנסטירטין וליזוזים51,52,53.למרות ש-NT הוא α-helix במצבו המקורי, כ-65% משרשרת הפוליפפטידים תואם להיווצרות רוכסן סטרי (איור 4ה) 45 .מכיוון שהמונומר נייד באופן דינמי46, הוא יכול לחשוף את האזורים העמילואידגנים הפוטנציאליים הללו בטמפרטורות גבוהות במידה בינונית ובריכוז גבוה של חלבון כולל יכול להגיע לריכוז קריטי ליצירת סיבים עמילואידים54.בעקבות נימוק זה, מצאנו מתאם שלילי בין ריכוז הספידרוין וזמן הג'ל (איור 1c), ואם הקונפורמציה המונומרית של NT מיוצבת על ידי מוטציות (NT*, His-NT-L6) או על ידי הוספת מלח, יכולה למנוע את היווצרות הידרוג'לים (איור 5).
ברוב המקרים, סיבים עמילואידים נעלמים מהתמיסה כמשקע, אך בתנאים מסוימים הם יכולים ליצור הידרוג'לים55,56,57.לסיבים היוצרים הידרוג'ל יש בדרך כלל יחס רוחב-גובה גבוה ויוצרים רשתות תלת-ממדיות יציבות באמצעות הסתבכות מולקולרית, 55,58 בהתאם לתוצאות שלנו.ליצירת הידרוג'ל במבחנה, חלבונים נפרשים לרוב באופן מלא או חלקי, למשל על ידי חשיפה לממיסים אורגניים, טמפרטורה גבוהה (70-90 מעלות צלזיוס) ו/או pH נמוך (1.5-3.0) 59,60,61,62.ההידרוג'לים של הספידרוין המתוארים כאן אינם דורשים עיבוד קשוח, וגם אינם דורשים חומרים מקשרים כדי לייצב את ההידרוג'לים.
בעבר דווח ש-spidroin חוזר ו-QDs, שנראה כי עוברים החלפת β-sheet במהלך ספינינג משי, יוצרים הידרוג'לים.בהשוואה לממצאים שלנו, זמני הדגירה ו/או טמפרטורות הדגירה היו ארוכים או גבוהים יותר באופן משמעותי, בהתאמה, וההידרוג'לים שהתקבלו היו לרוב אטומים (איור 7 וטבלה משלימה 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. בנוסף לזמני ג'ל מהירים, הידרוג'לים של NT מעל 300 מ"ג/מ"ל (30%) עמדו בביצועים טובים יותר מכל יתר ההידרוג'לים של חלבון משי עכביש רקומביננטי, כמו גם הידרוג'לים טבעיים כגון ג'לטין, אלגינט (2%), אגר (0.5% ) וקולגן.(0.6%) (איור 7 וטבלאות משלימות 1 ו-3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
זמן הג'ל ומודול הגמישות של ההידרוג'לים במחקר זה הושוו להידרוגלים אחרים מבוססי ספידרוין ולהידרוג'לים טבעיים נבחרים.ניתנות הפניות יחד עם תיאור של תנאי הג'ל.APS אמוניום פרסולפט, טמפרטורת החדר.נתונים 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
נראה כי עכבישים פיתחו דרכים למנוע מג'ל של ספידרוין במהלך האחסון.למרות הריכוז הגבוה של חלבון בבלוטת המשי, האזור החוזר הגדול המקושר לתחום הטרמינל פירושו שהריכוז הנראה של NT ו-CT בבלוטה מתאים לכ-10-20 מ"ג/מ"ל, בגבול מחקר זה.נדרש ליצירת הידרוג'ל שנצפה במבחנה.בנוסף, ריכוזים דומים של מלחים 16 ייצבו את NT, כמו בבלוטות משי (איור 5ב).קונפורמציה של NT נחקרה בציטוזול E. coli ונמצא שהיא מקופלת בחוזקה יותר מאשר כאשר נבדקה במבחנה, מה שמצביע עוד יותר על כך שמלח או גורמים אחרים מונעים את הצטברותו in vivo.עם זאת, היכולת של NTs להפוך לסיבים של β-sheet עשויה להיות חשובה להיווצרות נימה ויש לחקור אותה במחקרים עתידיים.
בנוסף להיבטים החדשים של היווצרות סיבים דמויי NT-עמילואיד והידרוג'ל שנצפו במחקר זה, אנו מראים גם שלתופעה זו עשויה להיות יישומים ביוטכנולוגיים וביו-רפואיים (איור 8).כהוכחה לקונספט, שילבנו NT עם GFP או PNP והראינו שחלבון ההיתוך יוצר גם הידרוג'לים כאשר דגירה ב-37 מעלות צלזיוס וכי חלקי ה-GFP וה-PNP שומרים במידה רבה על פעילותם לאחר הג'לציה (איור 6).נוקלאוזיד פוספורילאזים הם זרזים חשובים לסינתזה של אנלוגים נוקלאוזידים75, מה שהופך את התגלית שלנו לרלוונטית לתעשיית הביו-פרמצבטיקה.הרעיון של ביטוי חלבוני היתוך היוצרים הידרוג'לים שקופים בתנאים נוחים מאפשר יצירת הידרוג'לים מתפקדים בעלי תכונות טובות למגוון רחב של יישומים כגון אימוביליזציה של אנזים, שחרור מבוקר של תרופות והנדסת רקמות.בנוסף, NT ו-NT* הם סמני ביטוי יעילים30, מה שאומר שניתן להשתמש ב-NT ובגרסאותיו לייצור בתפוקה גבוהה של חלבוני היתוך מסיסים ויצירה לאחר מכן של חלבוני מטרה מקובעים בהידרוג'לים תלת מימדיים.
NT מסיס, α-סלילי ויציב בריכוזים נמוכים (µM) ו-37 מעלות צלזיוס.באותה טמפרטורה, אך בריכוזים עולים (>10 מ"ג/מ"ל), NT יוצר ג'לים המורכבים מסיבים דמויי עמילואיד.חלבוני היתוך NT יוצרים גם ג'לים פיברילרים עם שברי היתוך פונקציונליים במלואם, המאפשרים לשתק חלבונים שונים בהידרוג'לים תלת מימדיים באמצעות NT.תחתון: NT (PDB: 4FBS) והמחשות של רשתות סיבים ומבני חלבון קשורים (בהנחה ולא מצוירת בקנה מידה, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4JR).
המבנים (ראה טבלה משלימה 4 לרשימה מלאה הכוללת רצפי חומצות אמינו) שובטו לתוך פלסמיד pT7 והומרו ל-E. coli BL21 (DE3).E. coli המכילים פלסמידים מהונדסים חוסנו במרק Luria בתוספת קנאמיצין (70 מ"ג/ליטר) וגודלו למשך הלילה ב-30°C ו-250 סל"ד.לאחר מכן התרבית חוסן 1/100 לתוך מדיום LB המכיל קנאמיצין ותופחה ב-30°C ו-110 סל"ד עד שה-OD600 הגיע ל-0.8.עבור מחקרי NMR, גדלו חיידקים במדיום מינימלי M9 המכיל 2 גרם של D-glucose 13C (Aldrich) ו-1 גרם של אמוניום כלוריד 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) עבור סימון חלבון עם איזוטופים.מנמיכים את הטמפרטורה ל-20 מעלות צלזיוס ומשרים ביטוי חלבון עם 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (ריכוז סופי).לאחר ביטוי חלבון בן לילה, תאים נקצרו ב-7278×g, 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.כדורי תאים הושעו מחדש ב-20 מ"מ Tris-HCl, pH 8, והוקפאו עד לשימוש נוסף.תאים שהופשרו הוסרו באמצעות משבש תאים (מכונות מסדרת TS, Constant Systems Limited, אנגליה) ב-30 kPa.לאחר מכן בוצעה צנטריפוגה של הליסאטים ב-25,000 גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.עבור NTMiSp, לאחר מכן הגלולה הושעתה מחדש ב-2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, ועברה צלילים למשך 2 דקות (2 שניות הפעלה/כיבוי, 65%), ולאחר מכן עברה צנטריפוגה שוב ב-25,000 xg, 4°C בתוך 30 דק.הסופרנטנט הועלה על עמודת Ni-NTA, נשטף עם 20 מ"מ Tris-HCl, 2 מ"מ אימידאזול, pH 8, ולבסוף החלבון חולק עם 20 מ"מ Tris-HCl, 200 מ"מ אימידאזול, pH 8. כדי ליצור NT2RepCT ו NTCT, עיכול תרומבין מציג את האתר (ThrCleav) בין His ל-NT.אתרי ביקוע תרומבין קיימים גם ב-His-NT-ThrCleav-2Rep (מייצר 2Rep), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT (מייצר NT), His-Thioredoxin-ThrCleav-CT (מייצר CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (מייצר NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (מייצר NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (מייצר NTF1Sp), ו-His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (מייצר NTMiSp).המבנים עוכלו עם תרומבין (1:1000) ועברו דיאליזה למשך הלילה ב-4°C עם 20 mM Tris-HCl, pH 8, באמצעות קרום דיאליזה Spectra/Por עם סף משקל מולקולרי של 6-8 kDa.לאחר הדיאליזה, הפתרון מועמס על עמודת Ni-NTA והקולחים המכילים את החלבון המעניין נאספים.ריכוזי החלבון נקבעו על ידי מדידת ספיגת UV ב-280 ננומטר באמצעות מקדם ההכחדה של כל חלבון, למעט NTF1Sp, שהשתמש במבחן Bradford לפי פרוטוקול היצרן.הטוהר נקבע על ידי SDS polyacrylamide (4-20%) אלקטרופורזה של ג'ל וצביעה כחולה מבריקה Coomassie.החלבונים רוכזו באמצעות מסנני צנטריפוגה (VivaSpin 20, GE Healthcare) ב-4000 xg עם ניתוק משקל מולקולרי של 10 kDa במחזורים של 20 דקות.
הפשר את תמיסת החלבון והטפטף בזהירות 150 μl לתוך בקבוקון מחיצה שקוף של 1 מ"ל (8 x 40 מ"מ Thermo Scientific).הצינורות כוסו ואטמו בפאראפילם כדי למנוע אידוי.דגימות (n=3) הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס או 60 מעלות צלזיוס והופכו מעת לעת כדי לראות ג'לציה.דגימות שלא ג'ל הודגרו במשך שבוע לפחות.הפחת קשרי דיסולפיד של NTMiSp עם 10 מ"מ DTT לכל 10 מיקרומטר חלבון.כדי לנתח את הג'לציה של ציפויי משי עכביש טבעיים, עכביש הגשר השוודי נחתך, שתי הבלוטות הראשיות המופקות הונחו ב-200 μl של 20 mM Tris-HCl חיץ pH 8 ונחתכו כדי לאפשר לציפוי להיפרד מהבלוטות..תכולת הבלוטות מומסת במאגר, 50 μl לקביעת המשקל היבש (על ידי דגירה של בקבוקונים פתוחים ב-60 מעלות צלזיוס למשקל קבוע) ו-150 μl לג'לציה ב-37 מעלות צלזיוס.
גיאומטריית/כלי המדידה עשויים מנירוסטה באמצעות פלטה מקבילה בקוטר עליון של 20 מ"מ ורווח של 0.5 מ"מ.מחממים את המדגם מ-25 מעלות צלזיוס ל-45 מעלות צלזיוס ובחזרה ל-25 מעלות צלזיוס בקצב של 1 מעלות צלזיוס לדקה באמצעות פלטת פלטייר תחתונה מנירוסטה.מדידות רטט בוצעו בתדירות של 0.1 הרץ ובאזור הויסקו-אלסטי הליניארי של החומר במתח של 5% ו-0.5% עבור דגימות של 100 מ"ג/מ"ל ו-300-500 מ"ג/מ"ל, בהתאמה.השתמש בתא לחות מותאם אישית כדי למנוע אידוי.הנתונים נותחו באמצעות Prism 9.
לאיסוף ספקטרום אינפרא אדום (IR) בטמפרטורת החדר מ-800 עד 3900 ס"מ-1.מכשיר ה-ATR, כמו גם נתיב האור דרך הספקטרומטר, מטוהר באוויר מסונן יבש לפני ובמהלך הניסוי.תמיסות (500 מ"ג/מ"ל כדי למזער את שיאי ספיגת המים בספקטרום) הועברו לפיפטה על גבי הגבישים, וג'לים (500 מ"ג/מ"ל) נוצרו לפני המדידה ולאחר מכן הועברו לגבישים (n=3).1000 סריקות נרשמו ברזולוציה של 2 ס"מ-1 ואפס מחזור עבודה של 2. הנגזרת השנייה חושבה באמצעות OPUS (Bruker) תוך שימוש בטווח החלקה של תשע נקודות.הספקטרום נורמלו לאותו אזור אינטגרציה בין 1720 ל-1580 cm-1 באמצעות F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".בספקטרוסקופיה ATR-IR, עומק החדירה של קרן אינפרא אדום לדגימה תלוי במספר גלים, וכתוצאה מכך ספיגה חזקה יותר במספרי גל נמוכים יותר מאשר במספרי גל גבוהים יותר.השפעות אלו לא תוקנו עבור הספקטרום המוצג באיורים.3 כי הם קטנים מאוד (איור משלים 4).ספקטרום מתוקן עבור נתון זה חושבו באמצעות תוכנת Bruker OPUS.
באופן עקרוני, כימות מקיף של קונפורמציות חלבון אפשרי לאחר דקונבולציה מהימנה של הרכיבים בתוך שיא האמיד I.עם זאת, כמה מכשולים מתעוררים בפועל.רעש בספקטרום יכול להופיע כשיאים (שקריים) במהלך דקונבולציה.בנוסף, השיא עקב כיפוף המים עולה בקנה אחד עם מיקומו של שיא האמיד I וייתכן שיהיה לו גודל דומה עבור דגימות המכילות כמות גדולה של מים, כמו הג'ל המימי שנחקר כאן.לכן, לא ניסינו לפרק לחלוטין את שיא האמיד I, ויש לשקול את התצפיות שלנו רק כתמיכה בשיטות אחרות כגון ספקטרוסקופיה של NMR.
תמיסות של 50 מ"ג/מ"ל NT ו-His-NT2RepCT הועברו לג'ל למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, ההידרוג'ל דולל ב-20 מ"מ Tris-HCl (pH 8) לריכוז של 12.5 מ"ג/מ"ל, ניעור היטב והועבר לפיפטה כדי לשבור את הג'ל.לאחר מכן, ההידרוג'ל דולל 10 פעמים ב-20 מ"מ Tris-HCl (pH 8), 5 μl מהדגימה הוחלו על רשת נחושת מצופה ב-formvar, והדגימה העודפת הוסרה עם נייר סופג.דגימות נשטפו פעמיים עם 5 μl מים MilliQ והוצבעו ב-1% אורניל פורמט למשך 5 דקות.הסר כתם עודף עם נייר סופג, ולאחר מכן יבש את הרשת באוויר.הדמיה בוצעה על רשתות אלה באמצעות FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN הפועל ב-100 קילו וולט.התמונות תועדו בהגדלות של x 26,500 ו-x 43,000 באמצעות מצלמת CCD של Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, גרמניה).עבור כל דגימה (n = 1), נרשמו 10-15 תמונות.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) שימש לניתוח תמונה ומדידה של קוטרי סיבים (n = 100, סיבים שונים).פריזמה 9 שימשה לביצוע מבחני t לא מזווגים (דו זנבות).הממוצעים של סיבים His-NT2RepCT ו-NT היו 11.43 (SD 2.035) ו-7.67 (SD 1.389) ננומטר, בהתאמה.רווח הסמך (95%) הוא -4.246 עד -3.275.דרגות חופש = 198, p < 0.0001.
80 μl של דגימות נוזליות המכילות 10 μM thioflavin T (ThT) נמדדו בשלושה עותקים (n=3) בתנאים סטטיים באמצעות צלחות תחתיות שקופות בתחתית 96-בארות שחורה של Corning (Corning Glass 3881, ארה"ב).הבדלי הקרינה נרשמו באמצעות מסנן עירור של 440 ננומטר ומסנן פליטה של ​​480 ננומטר (FLUOStar Galaxy מ-BMG Labtech, Offenburg, גרמניה).אות ThT לא היה רווי ולא כווה, שכן ניסויים עם ריכוזים שונים של ThT בוצעו מבלי לשנות את עוצמת האות.שיא ספיגה ב-360 ננומטר למדידת אובך.עבור ניסויי זריעה, נוצרו ג'לים של 100 מ"ג/מ"ל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הושפו מחדש, ושימשו לזריעה ביחסים מולרים של 5%, 10% ו-20%.הנתונים נותחו באמצעות Prism 9.
להפשיר מלאי של His-NT2RepCT ו-NT >100 מ"ג/מ"ל על קרח ולסנן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.הריכוזים חושבו על ידי מדידת ספיגה ב-280 ננומטר באמצעות Nanodrop.בבארות של צלחת שחורה לא מחייבת 96 בארות (קורנינג) עם תחתית שקופה, דגימות הודללו ל-20 מ"ג/מ"ל ב-20 מ"מ Tris-HCl pH 8 ועורבבו עם 5 מיקרומטר ThT (ריכוז סופי), ריכוז הדגימה הכולל נפח 50 μl.דגימות צולמו כל 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס במיקרוסקופ CellObserver (Zeiss) עם ערוץ אור משודר וערכות מסנני עירור ופליטות FITC להדמיית ThT.להדמיה משתמשים בעדשת 20x/0.4.זן כחול (Zeiss) ו-ImageJ (https://imagej.nih.gov/) שימשו לניתוח תמונה.ג'לים הוכנו גם מתמיסות NT ו-His-NT2RepCT בריכוז של 50 מ"ג/מ"ל המכילים 20 מ"מ Tris pH 8 ו-5 מיקרומטר ThT והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.חתיכות הג'ל הועברו לבאר חדשה המכילה 20 מ"מ Tris, pH 8 ו-5 מיקרומטר ThT בצלחת תחתית שקופה שחורה 96 בארות לא מחייבות.רכוש קרינה ירוקה ותמונות שדה בהירות בהגדלה של 20x/0.4.ImageJ שימש לניתוח תמונה.
ספקטרום NMR של פתרון התקבלו ב-310 K בספקטרומטר Bruker Avance Neo 600 מגה-הרץ המצויד ב-QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).דגימות NMR המכילות 10 מ"ג/מ"ל חלבון הומוגני המסומן עם 13C, 15N, מומס ב-20 מ"מ Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .שינויים כימיים של NT2RepCT ב-pH 6.7 שימשו להקצאת שיא 23 בספקטרום הדו-ממדי של 15N-HSQC.
ספקטרום NMR מוצק (MAS) מסתובב של זווית קסומה של הידרוג'לים 13C, 15N מתויגים בספקטרומטר Bruker Avance III HD במהירות 800 מגה-הרץ מצויד בבדיקה נטולת אלקטרונים של 3.2 מ"מ 13C/15N{1H}.טמפרטורת הדגימה נשלטה באמצעות זרם גז בטמפרטורה משתנה ב-277 K. תהודה סיבובית דו-קוטבית (DARR)76 וספקטרום של חיבור תדר רדיו (RFDR)77 נרכשו בתדרי MAS של 12.5 קילו-הרץ ו-20 קילו-הרץ, בהתאמה.קיטוב צולב (CP) מ-1H ל-13C בוצע באמצעות רמפה ליניארית מ-60.0 ל-48.0 קילו-הרץ ב-1H, 61.3/71.6 קילו-הרץ ב-13C (ב-12.5/20 קילו-הרץ MAS) וזמן מגע 0.5-1 אלפיות השנייה.ניתוק Spinal6478 ב-73.5 קילו-הרץ שימש במהלך איסוף הנתונים.זמן הרכישה היה 10 מילישניות והשהיית המחזור הייתה 2.5 שניות.מתאמי ה-Cα/Cβ המקושרים היחידים שנצפו בספקטרום ה-RFDR הוקצו על סמך השינויים הכימיים האופייניים מסוג שאריות וקורלציות כפולות בספקטרום DARR.
מסד הנתונים Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) שימש להערכת נטיות רפרוף ואנרגיה של Rosetta עבור NT, NTFlSp ו-NTMiSp.מסד הנתונים Zipper מחשב את Rosetta Energy80, המשלב מספר פונקציות של אנרגיה חופשית למודל וניתוח של מבנה חלבון.רמת אנרגיה של -23 קק"ל/מול ומטה מעידה על נטייה גבוהה לפרפור.האנרגיה הנמוכה יותר פירושה יציבות רבה יותר של שני גדילי ה-β בקונפורמציה של הרוכסן.בנוסף, נעשה שימוש באלגוריתם Waltz כדי לחזות אזורים עמילואידוגניים ב-NT, NTFlSp ו-NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
תמיסת החלבון NT עורבבה עם חיץ 2-(N-מורפולינו) חומצה אתאן-סולפוני (MES) ב-pH 5.5 ו-6.0 כדי להוריד את ה-pH ל-pH 6 ו-7, בהתאמה.ריכוז החלבון הסופי היה 100 מ"ג/מ"ל.
המדידות בוצעו בספקטרומטר J-1500 CD (JASCO, ארה"ב) באמצעות קובטה של ​​300 μL עם נתיב אופטי של 0.1 ס"מ.חלבונים הודללו ל-10 מיקרומטר (n=1) במאגר פוספט של 20 מ"מ (pH 8).כדי לנתח את יציבות החלבון בנוכחות מלח, חלבונים נותחו באותו ריכוז (n=1) במאגר פוספט של 20 mM (pH 8) המכיל 154 mM NaF או NaCl, בהתאמה.סריקות טמפרטורה תועדו ב-222 ננומטר מ-25°C ל-95°C עם קצב חימום של 1°C/min.שיעור החלבונים המקופלים באופן טבעי חושב באמצעות הנוסחה (KDmeasure - KDfinal)/(KDstart - KDfinal).בנוסף, חמש ספקטרום נרשמו עבור כל דגימה מ-260 ננומטר עד 190 ננומטר ב-25 מעלות צלזיוס ולאחר חימום ל-95 מעלות צלזיוס.ממוצע של חמש ספקטרים ​​הוחלק, והומרו לאליפטיות טוחנת.הנתונים נותחו באמצעות Prism 9.
עוצמת הקרינה של His-NT-GFP (300 מ"ג/מ"ל, 80 μL) נמדדה בשלושה עותקים (n=3) בצלחות קורנינג 96 בארות עם תחתית שחורה ושקופה (Corning Glass 3881, ארה"ב) בתנאים סטטיים.מדוד דגימות עם קורא לוחות מבוסס פלואורסצנציה עם אורך גל עירור של 395 ננומטר ורשום את הפליטה ב-509 ננומטר לפני הג'ל ושעתיים לאחר מכן ב-37 מעלות צלזיוס.הנתונים נותחו עם Prism 9.
נעשה שימוש בערכת בדיקת פעילות נוקלאוזיד פוספורילאז של פורין (שיטה פלואומטרית, Sigma Aldrich) בהתאם להוראות היצרן.כדי למדוד פעילות בג'לים ותמיסות המכילות His-NT-PNP, ערבבו 10 ננוגרם של His-NT-PNP עם 100 מ"ג/מ"ל NT לנפח כולל של 2 μL מכיוון שהג'ל נתן אות מעל מרווח הזיהוי של הסט.בקרות לג'לים ותמיסות ללא His-NT-PNP נכללו.המדידות בוצעו פעמיים (n = 2).לאחר מדידת הפעילות, הוסרה תערובת התגובה והג'ל צולם כדי לוודא שהג'ל נשאר שלם במהלך המדידה.הנתונים נותחו באמצעות Prism 9.
למידע נוסף על עיצוב מחקר, עיין בתקציר מחקר הטבע המקושר למאמר זה.
איורים 1 ו-2 מציגים את הנתונים הראשוניים.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f ו-6, איורים משלימים.3, איור משלים.5א, ד, איור משלים.6 ואיור משלים.8. נתונים נתונים ממחקר זה מתארחים במסד הנתונים של Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.נתוני ה-NMR שהתקבלו במחקר זה פורסמו למאגר BMRBig תחת מזהה הערך bmrbig36.המבנים של GFP ו-PNP נלקחו מ-PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. and Johansson, J. Spinning משי עכביש מלאכותי.כימיקל לאומי.ביולוגיה.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.הגנום של Nephila clavipes מדגיש את מגוון הגנים של משי עכביש ואת הביטוי המורכב שלהם.לאומי ג'נט.49, 895–903 (2017).