347 12.7*1.24 מ"מ צינורות מפותלים מנירוסטה, מנגנון מולקולרי של עיבוי אלקטרוסטטי סינכרוני והצטברות של α-synuclein ו-tau

תודה שביקרת ב-Nature.com.אתה משתמש בגרסת דפדפן עם תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בנוסף, כדי להבטיח תמיכה שוטפת, אנו מציגים את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
סליידרים המציגים שלושה מאמרים בכל שקופית.השתמש בלחצנים 'הקודם' וה'הבא' כדי לעבור בין השקופיות, או בלחצני בקר השקופיות שבקצה כדי לעבור בין כל שקופית.

מפרט צינור נירוסטה 347

347 צינורות מפותלים מנירוסטה 12.7*1.24 מ"מ

קוטר חיצוני: 6.00 מ"מ OD עד 914.4 מ"מ OD, גדלים עד 24 אינץ' NB זמין במלאי, גודל OD צינורות פלדה זמינים במלאי

טווח עובי צינור SS 347: 0.3 מ"מ – 50 מ"מ, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S וכו' (0.5-12 מ"מ) או גודל לא רגיל להתאמה לפי הצורך

סוג: צינורות ללא תפרים SS 347 |צינורות SS 347 ERW |צינורות מרותכים SS 347 |צינורות מיוצרים SS 347 |צינורות SS 347 CDW, צינורות LSAW / מרותכים בתפרים / משורטטים מחדש

צורה: צינורות/צינורות עגולים SS 347, צינורות/צינורות מרובעים SS 347, צינורות/צינורות מלבניים SS 347, צינורות מפותלים SS 347, צורת U SS 347, סלילי פאן קייק SS 347, צינורות הידראוליים SS 347

אורך: אקראי יחיד, אקראי כפול וקצה אורך נדרש: קצה רגיל, קצה משופע, מדורג

הגנת קצה: כובעי פלסטיק |גימור חיצוני: 2B, No.4, No.1, No.8 גימור מראה לצינורות נירוסטה, גימור לפי דרישות הלקוח

מצב אספקה: חישול וכבוש, מלוטש, חישול בהיר, משיכה קרה

בדיקה, דוחות בדיקה: תעודות בדיקה של מיל, EN 10204 3.1, דוחות כימיים, דוחות מכניים, דוחות בדיקות PMI, דוחות בדיקה חזותית, דוחות בדיקה של צד שלישי, דוחות מעבדה מאושרים NABL, דוחות בדיקה הרסניים, דוחות בדיקה לא הרסניים

אריזה: ארוז בקופסאות עץ, שקיות פלסטיק, רצועות פלדה ארוזות, או לפי בקשת לקוחות

מבצעים: ניתן לייצר גדלים ומפרטים שאינם לעיל לפי בקשה

טווח גודל צינור SS 347: 1/2 אינץ' NB, OD עד 24 אינץ'

ASTM A312 347: צינור אוסטניטי מרותך ללא תפר ותפר ישר המיועד לטמפרטורה גבוהה ולשירות מאכל כללי.מתכת מילוי אסורה במהלך הריתוך.

ASTM A358 347: צינור אוסטניטי מרותך בהיתוך חשמלי לשירות קורוזיבי ו/או בטמפרטורה גבוהה.בדרך כלל רק צינור עד 8 אינץ' מיוצר לפי מפרט זה.הוספת מתכת מילוי מותרת במהלך הריתוך.

ASTM A790 347: צינור פריטי/אוסטניטי (דופלקס) מרותך ללא תפרים וישר המיועד לשירות קורוזיבי כללי, עם דגש מיוחד על עמידות בפני פיצוח קורוזיה מתח.

ASTM A409 347: צינור קיר אור אוסטניטי בעל תפר ישר או תפר ספירלי מרותך חשמלי בקוטר גדול בגדלים 14" עד 30" עם קירות Sch5S ו-Sch 10S עבור קורוזיבי ו/או גבוה

ASTM A376 347: צינור אוסטניטי חלק ליישומים בטמפרטורה גבוהה.

ASTM A813 347: צינור אוסטניטי חד-תפר, מרותך יחיד או כפול, ליישומים בטמפרטורה גבוהה ויישומים קורוזיביים כלליים.

ASTM A814 347: צינור אוסטני מרותך בעבודות קרה עבור טמפרטורה גבוהה ושירות קורוזיבי כללי.

צינורות נירוסטה 347H הרכב כימי

מאפיינים מכניים של צינור נירוסטה 347H

צינורות נירוסטה 347H מאפיינים פיזיים

ציונים שוות ערך עבור צינור נירוסטה 347H

הצטברות עמילואיד אלפא-סינוקלאין (αS) היא סימן היכר של מחלת פרקינסון וסינוקליינופתיות אחרות.לאחרונה, חלבון הטאו המזוהה בדרך כלל עם מחלת אלצהיימר נקשר לפתולוגיה של αS ונמצא כמקומו במשותף בתכלילים עשירים ב-αS, אם כי המנגנון המולקולרי של חיבור של שני החלבונים נותר לא ברור.אנו מדווחים כאן כי שלב αS נפרד לעיבוי נוזלי באמצעות עיבוי קומפלקס אלקטרוסטטי עם פוליפפטידים טעונים חיובית כגון טאו.בהתאם לזיקה של αS לפוליקטונים ולקצב דלדול הערכיות של רשת הקרישה, הקרישים עוברים ג'לציה או התלכדות מהירה ואחריה צבירה איטית של עמילואיד.על ידי שילוב של חבילה של טכניקות ביו-פיזיקליות מתקדמות, הצלחנו לאפיין את ההפרדה של נוזל-נוזל αS/Tau ולזהות את גורמי המפתח המובילים ליצירת אגרגטים הטרוגניים המכילים את שני החלבונים בעיבוי חלבון נוזלי.
בנוסף לתאי הממברנה, הפרדה מרחבית בתאים יכולה להיות מושגת גם על ידי היווצרות של גופים צפופים דמויי-נוזל עשירים בחלבון הנקראים קונדנסטים ביו-מולקולריים או טיפות, באמצעות תהליך המכונה הפרדת שלב נוזלי-נוזל (LLPS).טיפות אלו נוצרות על ידי אינטראקציות זמניות רב ערכיות, בדרך כלל בין חלבונים או חלבונים ל-RNA, ומשרתות מגוון פונקציות כמעט בכל מערכות החיים.מספר רב של חלבונים בעלי יכולת LLP מציגים רצפים בעלי מורכבות נמוכה, שהם מאוד לא מסודרים בטבעם וביצירת קונדנסטים ביו-מולקולריים3,4,5.מחקרים ניסויים רבים חשפו את האופי הגמיש, המעורער והרב-ערכי של החלבונים המרכיבים את הקונדנסטים דמויי הנוזל הללו, אם כי מעט ידוע על הקובעים המולקולריים הספציפיים השולטים בגדילה ובהבשלה של עיבויים אלה למוצקים יותר. מדינה..
הנתונים החדשים תומכים בהשערה ש-LLPS חריג מונע על ידי חלבון והפיכת טיפות למבנים מוצקים עשויים להיות מסלולים תאיים רלוונטיים המובילים להיווצרות של אגרגטים רעילים בלתי מסיסים שהם לרוב סימני היכר של מחלות ניווניות.חלבונים רבים הקשורים ל-LLPS עם הפרעות מהותית (IDPs), לעתים קרובות טעונים מאוד וגמישים, קשורים זה מכבר לניוון עצבי באמצעות תהליך צבירה עמילואיד.בפרט, הוכח כי עיבוי IDP ביומולקולרי כגון FUS7 או TDP-438 או חלבונים בעלי תחומים גדולים במורכבות נמוכה כגון hnRNPA19 מזדקנים לצורות דמויות ג'ל או אפילו מוצקות באמצעות תהליך הנקרא נוזליזציה.מתחם.למעבר פאזה מוצק (LSPT) כפונקציה של זמן או בתגובה לשינויים מסוימים לאחר תרגום או למוטציות משמעותיות מבחינה פתולוגית1,7.
IDP נוסף הקשור ל-LLPS in vivo הוא Tau, חלבון עם הפרעות הקשורות למיקרו-צינוריות, שצבירת העמילואיד שלו הייתה מעורבת במחלת אלצהיימר10, אך לאחרונה הייתה מעורבת גם במחלת פרקינסון (PD) ופרוטאינופתיות גרעיניות סינפטיות אחרות 11, 12, 13 קשורות.הוכח כי טאו מתנתק באופן ספונטני מתמיסה/ציטופלזמה עקב אינטראקציות אלקטרוסטטיות חיוביות14, וכתוצאה מכך נוצרות טיפות מועשרות בטאו הידועות כקואצרבטים אלקטרוסטטיים.כמו כן, נצפה שסוג זה של אינטראקציה לא ספציפית הוא הכוח המניע מאחורי קונדנסטים ביו-מולקולריים רבים בטבע15.במקרה של חלבון טאו, צבירה אלקטרוסטטית יכולה להיווצר על ידי צבירה פשוטה, שבה אזורים טעונים הפוך של החלבון מפעילים את תהליך הביקוע, או על ידי צבירה מורכבת באמצעות אינטראקציה עם פולימרים בעלי מטען שלילי כגון RNA.
לאחרונה, α-synuclein (αS), עמילואיד IDP מעורב ב-PD ומחלות ניווניות אחרות הידועות ביחד בשם synucleinopathy17,18, הוכח במודלים תאיים ובעלי חיים19,20 מרוכזים בקונדנסטים של חלבונים עם התנהגות דמוית נוזל.מחקרים במבחנה הראו כי αS עובר LLPS על ידי צבירה פשוטה באמצעות אינטראקציות הידרופוביות בעיקר, אם כי תהליך זה דורש ריכוזי חלבון גבוהים במיוחד וזמני דגירה ארוכים באופן לא טיפוסי19,21.האם הקונדנסטים המכילים αS שנצפו in vivo נוצרים על ידי תהליכי LLPS זה או אחרים, נותרה בעיה מרכזית לא פתורה.באופן דומה, למרות שנצפתה צבירת עמילואיד αS בנוירונים ב-PD ובסינוקליינופתיות אחרות, המנגנון המדויק שבו αS עובר צבירת עמילואיד תוך תאית נותר לא ברור, שכן נראה שביטוי יתר של חלבון זה לא מפעיל תהליך זה בעצמו.נזק תאי נוסף נדרש לעתים קרובות, מה שמרמז על כך שמקומות תאיים מסוימים או מיקרו-סביבות מסוימות נדרשות לחידוש גרעין של מכלולי עמילואיד αS תוך-תאיים.סביבה תאית אחת הנוטה במיוחד להצטברות עשויה להיות החלק הפנימי של עיבוי חלבונים 23 .
מעניין לציין כי αS ו-tau נמצאו כמקומם במשותף בתכלילים של מחלות אופייניות בבני אדם עם מחלת פרקינסון וסינוקליינופתיות אחרות 24,25 וניסויים דיווחו על קשר פתולוגי סינרגטי בין שני החלבונים 26,27 המצביע על קשר פוטנציאלי בין אגרגציה αS ו- טאו במחלות נוירודגנרטיביות.מחלה.נמצא כי αS ו-tau מקיימים אינטראקציה ומקדמים את ההצטברות של זה במבחנה וב-in vivo 28,29 ואגרגטים הטרוגניים המורכבים משני חלבונים אלו נצפו במוחם של חולים עם סינוקלינופתיות 30 .עם זאת, מעט ידוע על הבסיס המולקולרי של האינטראקציה בין αS ל-tau ועל מנגנון הצבירה המשותפת שלו.דווח על אינטראקציה של αS עם טאו באמצעות משיכה אלקטרוסטטית בין אזור ה-C-termine בעל הטעינה שלילית של αS לבין האזור המרכזי העשיר בפרולין של טאו, המועשר גם בשאריות טעונות חיובית.
במחקר זה, אנו מראים כי αS אכן יכול להתנתק לטיפות באמצעות עיבוי קומפלקס אלקטרוסטטי בנוכחות חלבון טאו, בניגוד לאינטראקציה שלו עם פוליפפטידים בעלי מטען חיובי אחרים כגון פולי-L-ליזין (pLK), ובתהליך זה.αS פועלת כמולקולת פיגום לרשת הטיפות.זיהינו הבדלים בולטים בתהליך ההתבגרות של coacervates αS אלקטרוסטטיים, אשר קשורים להבדלים בערכיות וחוזק האינטראקציה של חלבונים המעורבים ברשת coacervate.מעניין לציין שצפינו בצבירה משותפת של חלבוני עמילואיד αS וטאו בקואסרבטים נוזליים ארוכים וזיהינו כמה גורמים מרכזיים שמובילים לצבירה משותפת של שני חלבונים אלה בקואסרבטים כאלה.כאן אנו מתארים בפירוט תהליך זה, שהוא מנגנון מולקולרי אפשרי העומד בבסיס ה-colocalization של שני חלבונים בתכלילים ספציפיים למחלה.
ל-αS יש זנב C-terminal מאוד אניוני ב-pH ניטרלי (איור 1a), והשערנו שהוא יכול לעבור LLPS דרך עיבוי של קומפלקסים אלקטרוסטטיים עם מולקולות פוליפפטידים פולקציוניות מופרעות.השתמשנו בפולי-L-ליזין של 100 שאריות (pLK) כמולקולת המודל ההתחלתית בשל האופי הפולימרי הטעון החיובי והמסודר שלה ב-pH ניטרלי 32. ראשית, אישרנו ש-pLK מקיים אינטראקציה עם תחום ה-Ct של αS באמצעות ספקטרוסקופיה של Solution NMR (איור 1b) באמצעות 13C/15N שכותרתו αS בנוכחות הגדלת היחסים המולאריים αS:pLK.האינטראקציה של pLK עם ה-Ct-domain של αS מתבטאת בהפרעות של השינוי הכימי וירידה בעוצמת השיא באזור זה של החלבון.מעניין שכאשר ערבבנו αS עם pLK בריכוז αS של כ.5-25 מיקרומטר בנוכחות פוליאתילן גליקול (5-15% PEG-8) (חיץ LLPS טיפוסי: 10 מ"מ HEPES pH 7.4, 100 מ"מ NaCl, 15% PEG-8) עברנו מיד תחום רחב של יצירת חלבונים .טיפות נצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (WF) ושדה בהיר (BF) (איור 1c).טיפות של 1-5 מיקרומטר המכילות αS מרוכז (בתוספת 1 מיקרומטר AlexaFluor488 שכותרתו αS, AF488-αS), ניתן להפיק את התכונות האלקטרוסטטיות שלהן מההתנגדות שלהן ל-10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) ורגישותו ל עלייה בריכוז NaCl (איור 1c).האופי הדומה לנוזל של ה-coacervates של הקומפלקס האלקטרוסטטי αS/pLK מודגם על ידי יכולתם להתמזג תוך אלפיות שניות (איור 1ד).באמצעות עכירות, כימתנו את היווצרותן של טיפות בתנאים אלה, אישרנו את האופי האלקטרוסטטי של האינטראקציה העיקרית הקשורה ליציבותה (איור 1ה), והערכנו את ההשפעה של יחסי פולימרים שונים על תהליך ה-LLPS (איור 1f).למרות שהיווצרות טיפות נצפתה על פני מגוון רחב של יחסי פולימרים, התהליך נוח מאוד כאשר pLK עולה על αS.LLPs נצפו גם תוך שימוש בחומר העקירה השונה מבחינה כימית Dextran-70 (70 kDa) או בשימוש במגוון פורמטים לדוגמא, כולל טיפות שקופיות זכוכית, בארות מיקרופליט מחומרים שונים, נימי אפנדורף או קוורץ.
ייצוג סכמטי של אזורי חלבון שונים בווריאציות WT-αS ו-ΔCt-αS המשמשות במחקר זה.התחום האמפיפתי N-terminal, האזור הידרופובי ליצירת עמילואיד (NAC) ותחום C-terminal הטעון שלילי מוצגים בכחול, כתום ואדום, בהתאמה.מוצגת המפה של תשלום נטו לשארית (NCPR) של WT-αS.b ניתוח NMR של האינטראקציה αS/pLK בהיעדר גושים מקרומולקולריים.כאשר ריכוז pLK עולה (יחסים מולרים של αS:pLK של 1:0.5, 1:1.5 ו-1:10 מוצגים בירוק בהיר, ירוק וירוק כהה, בהתאמה).c Coacervate αS/pLK (יחס מולארי 1:10) ב-25 µM (1 µM AF488 שכותרתו αS או Atto647N-pLK עבור הדמיית WF) במאגר LLPS (למעלה) או בתוספת 500 mM NaCl (משמאל למטה) או אחרי 10 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; מימין למטה).סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר.ד תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של היתוך טיפות BF של αS/pLK (יחס מולארי 1:10) בריכוז של 25 מיקרומטר;חיצים מציינים מיזוג של טיפות בודדות (חצים אדומים וצהובים) לטיפה חדשה (חץ כתום) תוך 200 אלפיות השנייה).סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר.e פיזור אור (ב-350 ננומטר) צבירה של αS/pLK במאגר LLPS לפני ואחרי הוספה של 500 mM NaCl או 10% 1,6-HD ב-25 μM αS (N = 3 שכפולים של דגימה, ממוצע וסטיית תקן מצוין גם).f תמונת BF (למעלה) וניתוח פיזור אור (ב-350 ננומטר, תחתון) של צבירה של αS/pLK ב-25 מיקרומטר αS עם הגדלת היחס המולארי αS:pLK (N = 3 דגימות משוכפלות, ממוצע וסטיית תקן מצוין גם).סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.סרגל קנה המידה בתמונה אחת מציין את קנה המידה של כל התמונות בחלונית אחת.נתונים גולמיים מסופקים בצורה של קבצי נתונים גולמיים.
בהתבסס על התצפיות שלנו על עיבוי קומפלקס אלקטרוסטטי αS/pLK ותצפיות קודמות של αS כמולקולת לקוח של עיבוי tau/RNA באמצעות אינטראקציה ישירה עם tau31, שיערנו ש-αS ו-tau יכולים להיפרד יחד עם הממס בהיעדר RNA הִתְעַבּוּת.באמצעות קומפלקסים אלקטרוסטטיים, ו-αS הוא חלבון הפיגום ב-αS/Tau coacervates (ראה חלוקת מטען טאו באיור 2e).ראינו שכאשר 10 מיקרומטר αS ו-10 מיקרומטר Tau441 (המכילים 1 מיקרומטר AF488-αS ו-1 מיקרומטר Atto647N-Tau, בהתאמה) היו מעורבבים יחד במאגר LLPS, הם יצרו בקלות אגרגטים חלבונים המכילים את שני החלבונים, כפי שניתן לראות במיקרוסקופ WF.(איור 2א).ה-colocalization של שני החלבונים בטיפות אושרה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (CF) (איור משלים. 1a).התנהגות דומה נצפתה כאשר dextran-70 שימש כסוכן צבירה (איור משלים. 1c).באמצעות שימוש ב-PEG שכותרתו FITC או דקסטרן, מצאנו ששני סוכני הצפיפות התפזרו באופן שווה על פני הדגימות, ולא הראו הפרדה או אסוציאציה (איור משלים. 1d).במקום זאת, זה מצביע על כך שבמערכת זו הם מקדמים הפרדת פאזות באמצעות השפעות צפיפות מאקרו-מולקולריות, מכיוון ש-PEG הוא חומר צפיפות יציב עדיפות, כפי שניתן לראות במערכות LLP אחרות33,34.טיפות עשירות בחלבון אלו היו רגישות ל-NaCl (1 M) אך לא ל-1,6-HD (10% v/v), מה שמאשר את התכונות האלקטרוסטטיות שלהן (איור משלים. 2a, b).התנהגות הנוזל שלהם אושרה על ידי התבוננות באירועי טיפות מיזוג של אלפיות שנייה באמצעות מיקרוסקופיה BF (איור 2b).
תמונות מיקרוסקופיה Confocal (CF) של αS/Tau441 coacervates במאגר LLPS (10 מיקרומטר מכל חלבון, 0.5 מיקרומטר של AF488 המסומן αS ו-Ato647N שכותרתו Tau441).בתמונות נציג ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) של אירועי היתוך טיפות αS/Tau441 (10 מיקרומטר לכל חלבון).c דיאגרמת פאזות המבוססת על פיזור אור (ב-350 ננומטר) של Tau441 LLPS (0-15 µM) בהיעדר (משמאל) או נוכחות (ימין) של 50 µM αS.צבעים חמים יותר מעידים על פיזור רב יותר.ד פיזור אור של דגימות αS/Tau441 LLPS עם ריכוז αS הולך וגובר (Tau441 ב-5 µM, N = 2-3 חזרות מדגם כפי שצוין).ייצוג סכמטי של כמה גרסאות חלבון טאו ואזורים שונים של החלבון המשמשים במחקר זה: תחום N-termine בעל מטען שלילי (אדום), אזור עשיר בפרולין (כחול), תחום קושר מיקרו-צינוריות (MTBD, מודגש בכתום) ו ספירלת זוג היוצר עמילואיד.אזורי חוט נימה (PHF) הממוקמים בתוך ה-MTBD (אפור).מוצגת המפה של תשלום נטו לכל שארית (NCPR) של Tau441.ושימוש ב-1 µM AF488 המסומן αS ו-Ato647N המסומן ΔNt-, שימוש ב-1 µM AF488 מסומן αS או ΔCt-αS בנוכחות ΔNt-Tau (עליון, 10 µM לחלבון) או µM חלבון תחתון (תחתון) ) ) ) צילומי מיקרו של WF מעובה במאגר LLPS או K18.פסי קנה המידה בתמונה אחת מייצגים את קנה המידה של כל התמונות בלוח אחד (20 מיקרומטר עבור לוחות a, b ו-f).נתונים גולמיים עבור לוחות c ו-d מסופקים כקבצי נתונים גולמיים.
כדי לבדוק את התפקיד של αS בתהליך LLPS זה, חקרנו תחילה את ההשפעה של αS על יציבות הטיפות על ידי נפלומטריה תוך שימוש בריכוזים הולכים וגדלים של NaCl (איור 2c).ככל שריכוז המלח בדגימות המכילות αS גבוה יותר, כך ערכי פיזור האור גבוהים יותר (ב-350 ננומטר), מה שמעיד על תפקיד הייצוב של αS במערכת LLPS זו.ניתן לראות השפעה דומה על ידי הגדלת ריכוז αS (ומכאן יחס αS:Tau441) לכ.עלייה של פי 10 ביחס לריכוז הטאו (5 מיקרומטר) (איור 2ד).כדי להדגים כי αS הוא חלבון פיגום ב-coacervates, החלטנו לחקור את ההתנהגות של מוטנט Tau מופרע ב-LLPS, אשר חסר אזור N-termine בעל מטען שלילי (שאריות 1-150, ראה איור 2e) הנקרא ΔNt-Tau.מיקרוסקופיה ונפלומטריה של WF אישרו כי ΔNt-Tau עצמו לא עבר LLPS (איור 2f ואיור משלים. 2d), כפי שדווח בעבר 14. עם זאת, כאשר αS נוספה לפתרונות פיזור של וריאנט טאו קטום זה, תהליך ה-LLPS היה לחלוטין שוחזר עם צפיפות טיפות קרובה לצפיפות הטיפות של תמיסות בגודל מלא של Tau ו-αS בתנאים דומים ובריכוזי חלבון.תהליך זה יכול להיות נצפה גם בתנאים של צפיפות מקרומולקולרית נמוכה (איור משלים. 2c).תפקידו של אזור ה-C-טרמינלי αS, אך לא לכל אורכו, בתהליך ה-LLPS הודגם על ידי עיכוב של יצירת טיפות באמצעות וריאנט αS קטום מ-C-טרמינלי חסר שאריות 104-140 (איור 1a) של (ΔCt- αS) חלבון (איור 2f ואיור משלים 2d).ה-colocalization של αS ו-ΔNt-Tau אושרה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקאלי (איור משלים. 1b).
כדי להמשיך ולבחון את מנגנון ה-LLPS בין Tau441 ל-αS, נעשה שימוש בגרסה נוספת של Tau, כלומר מקטע ליבת חוט הלהט המזווג (PHF) בתחום ה-microtubule-binding domain (MTBD), שאם הוא מכיל ארבעה תחומים חוזרים אופייניים, הידועים בדרך כלל גם כשבר K18 (ראה איור 2ה).לאחרונה דווח כי αS נקשר באופן מועדף לחלבון טאו הממוקם בתחום עשיר בפרולין ברצף שלפני התחום קושר למיקרו-צינוריות.עם זאת, אזור ה-PHF עשיר גם בשאריות טעונות חיוביות (ראה איור 2ה), במיוחד ליזין (15% שאריות), מה שגרם לנו לבדוק האם אזור זה תורם גם לעיבוי של קומפלקס αS/Tau.ראינו ש-K18 לבדו לא יכול להפעיל LLPS בריכוזים של עד 100 מיקרומטר בתנאים שנבדקו (מאגר LLPS עם 15% PEG או 20% דקסטרן) (איור 2ו).עם זאת, כאשר הוספנו 50 µM αS ל-50 µM K18, היווצרות מהירה של טיפות חלבון המכילות K18 ו- αS נצפתה על ידי נפלומטריה (איור משלים. 2d) ומיקרוסקופיה WF (איור 2f).כצפוי, ΔCt-αS לא הצליח לשחזר את התנהגות ה-LLPS של K18 (איור 2f).אנו מציינים כי צבירה של αS/K18 דורשת ריכוזי חלבון מעט גבוהים יותר כדי לגרום ל-LLPS בהשוואה ל-αS/ΔNt-Tau או αS/Tau441, כששאר הדברים שווים.זה עולה בקנה אחד עם אינטראקציה חזקה יותר של אזור αS C-טרמינלי עם תחום Tau העשיר בפרולין בהשוואה לתחום קושר המיקרוטובוליות, כפי שתואר קודם לכן 31 .
בהתחשב בכך ש-ΔNt-Tau אינו יכול לבצע LLPS בהיעדר αS, בחרנו בגרסה זו של Tau כמודל לאפיון αS/Tau LLPS בהתחשב בפשטותו במערכות LLPS עם טאו באורך מלא (איזוטיפ, Tau441/Tau441).עם תהליכי צבירה מורכבים (הטרוטיפיים, αS/Tau441).השווינו את מידת הצבירה של αS (כחלק מחלבון הפאזה המעובה, fαS,c) במערכות αS/Tau ו-αS/ΔNt-Tau על ידי צנטריפוגה וניתוח SDS-PAGE של שלב מפוזר (ראה 2e), מצאנו ערכים דומים מאוד עבור כל החלבונים באותו ריכוז.בפרט, השגנו fαS,c 84 ± 2% ו-79 ± 7% עבור αS/Tau ו-αS/ΔNt-Tau, בהתאמה, מה שמצביע על כך שהאינטראקציה ההטרוטיפית בין αS וטאו עדיפה על האינטראקציה בין מולקולות טאו.בֵּין.
האינטראקציה עם פוליקציות שונות והשפעת תהליך העיבוי על קינטיקה של αS נחקרו לראשונה על ידי שיטת התאוששות פלואורסצנטי לאחר פוטובלינג (FRAP).בדקנו αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ו-αS/pLK coacervates (100 μM αS בתוספת 2 μM αS AF488-αS ו-100 μM Tau441 או ΔNt-Tau או 1 mM pLK).הנתונים התקבלו בתוך 30 הדקות הראשונות לאחר ערבוב רכיבי הדגימה.מתמונות FRAP מייצגות (איור 3a, עיבוי αS/Tau441) ועקומות מהלך הזמן המקבילות שלהן (איור 3b, איור משלים 3), ניתן לראות כי קינטיקה של αS דומה מאוד לאלו של Coacervates של Tau441.ו- ΔNt-Tau, שהוא הרבה יותר מהיר עם pLK.מקדמי הדיפוזיה המחושבים עבור αS בתוך ה-coacervate לפי FRAP (כפי שמתואר על ידי Kang וחב' 35) הם D = 0.013 ± 0.009 µm2/s ו-D = 0.026 ± 0.008 µm2/s עבור αS/Tau441 ו-αN-t forΔ מערכת αS/.pLK, Tau ו-D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, בהתאמה (איור 3c).עם זאת, מקדם הדיפוזיה αS בשלב המפוזר גבוה בכמה סדרי גודל מכל השלבים המעובה, כפי שנקבע על ידי ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (FCS, ראה איור משלים. 3) באותם תנאים (מאגר LLPS) אך בהיעדר פוליקציות ( D = 8 ± 4 µm2/s).לכן, הקינטיקה של תרגום αS מופחתת באופן משמעותי בקואסרבטים בהשוואה לחלבונים בשלב המפוזר עקב השפעות צפיפות מולקולריות בולטות, אם כי כל הקואצרבטים שומרים על תכונות דמויות נוזל במהלך חצי השעה הראשונה לאחר היווצרותם, בניגוד לשלב הטאו.קינטיקה מהירה יותר בקונדנסט pLK.
ניתוח FRAP a–c של דינמיקה של αS (2% עם AF488 שכותרתו αS) ב-coacervates אלקטרוסטטי.תמונות מייצגות של מבחני FRAP αS/Tau441 בשלושה עותקים מוצגות ב-(א), כאשר עיגולים אדומים מציינים אזורים שעברו צבע.סרגל קנה המידה הוא 5 מיקרומטר.ב עקומות FRAP ממוצעות ו-(ג) מקדמי דיפוזיה מחושבים (D) עבור 5-6 (N) טיפות שונות משלושה ניסויים באמצעות 100 µM αS וריכוזים אקוומולריים של Tau441 (אדום) או ΔNt-Tau (כחול) או pLK (ירוק) בריכוז פי עשרה מ-LLPS.סטיית התקן של עקומת FRAP מוצגת בצבע מוצל.לשם השוואה, מקדם הדיפוזיה αS בשלב המפוזר נקבע בשלושה עותקים באמצעות ספקטרוסקופיה של קורלציה פלואורסצנטית (FCS) (ראה איור משלים 3 ושיטות למידע נוסף).ד ספקטרום X-band EPR רציף של 100 מיקרומטר TEMPOL-122-αS במאגר LLPS ללא כל פוליקציה (שחור) או בנוכחות 100 מיקרומטר Tau441 (אדום) או ΔNt-Tau (כחול) או 1 mM pLK (ירוק).התוספת מציגה תצוגה מוגדלת של קווי השדה החזקים שבהם מתרחשים השינויים הדרמטיים ביותר.e עקומות מחייבות של 50 מיקרומטר TEMPOL-122-αS עם פוליקציות שונות בהעדר LLPS (ללא PEG).האמפליטודה המופחתת של פס III בהשוואה ללהקה II (IIII/III) של ספקטרום ה-EPR המנורמל מגדילה את היחסים המולאריים של Tau441 (אדום), ΔNt-Tau (כחול) ו-pLK (ירוק).קווים צבעוניים מראים התאמה לנתונים באמצעות מודל קשירה גס עם n אתרי קישור זהים ובלתי תלויים בכל עקומה.נתונים גולמיים מסופקים בצורה של קבצי נתונים גולמיים.
כהשלמה, חקרנו את הדינמיקה של αS ב-coacervates שונים באמצעות תיוג ספין מכוון (SDSL) ותהודה פרמגנטית אלקטרונית רציפה (CW-EPR).שיטה זו הוכחה כמועילה מאוד בדיווח על הגמישות והדינמיקה של ה-IDP עם רזולוציה שיורית מציאותית36,37,38.לשם כך, בנינו שאריות ציסטאין במוטציות Cys בודדות והשתמשנו ב-4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) ספין פרוב.נגזרות מאלימיד מסמנות אותן.ליתר דיוק, הכנסנו בדיקות TEMPOL בעמדה 122 או 24 αS (TEMPOL-122-αS ו-TEMPOL-24-αS).במקרה הראשון, אנו מכוונים לאזור C-terminal של החלבון, המעורב באינטראקציה עם פוליקציות.במקום זאת, מיקום 24 יכול לתת לנו מידע על הדינמיקה הכוללת של החלבונים בעיבוי.בשני המקרים, אותות ה-EPR שהתקבלו עבור חלבונים מהפאזה המפוזרת תאמו לרדיקלים של ניטרוקסיד במצב הנע במהירות.לאחר הפרדת פאזות בנוכחות tau או pLK (100 מיקרומטר TEMPOL-αS, Tau441 או ΔNt-Tau ביחס של 1:1 או pLK ביחס של 1:10), נצפתה עלייה בעוצמת השיא היחסית ב ספקטרום EPR של αS.קו ההפסד התרחב, והצביע על קינטיקה מופחתת של כיוון מחדש של αS בטיפות בהשוואה לחלבון בשלב דליל (איור 3ד, איור משלים 4a).שינויים אלו בולטים יותר בעמדה 122. בעוד שבעמדה 24 נוכחות pLK לא השפיעה על הקינטיקה של הבדיקה, בעמדה 122 צורת הקו הספקטרלי השתנתה באופן משמעותי (איור משלים. 4a).כאשר ניסינו ליצור מודל של הספקטרום בעמדה 122 של שתי מערכות αS/פוליקטיון באמצעות המודל האיזוטרופי (איור משלים 5a) המשמש בדרך כלל לתיאור הדינמיקה של IDP38,39 המסומן בספין, לא הצלחנו לשחזר את הספקטרום הניסוי..הדמיה ספקטרלית של המיקום של ניגודים של 24 ספינים (איור משלים. 5a).זה מצביע על כך שיש מיקומים מועדפים במרחב של תצורות ספין של אזור C-טרמינלי של αS בנוכחות פוליקציות.כאשר שוקלים את החלק של αS בשלב המעובה בתנאי EPR ניסיוניים (84 ± 2%, 79 ± 7% ו-47 ± 4% עבור αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ו-αS/pLK, בהתאמה - ראה משלים איור 2e של ניתוח נתונים ג), ניתן לראות שההרחבה שזוהתה בשיטת EPR משקפת בעיקר את האינטראקציה של אזור ה-C-terminal של αS עם פוליקציות שונות בשלב המעובה (השינוי העיקרי בשימוש ב-TEMPOL-122- αS), ולא עיבוי חלבון.עלייה במיקרו-צמיגות נצפית בבדיקה.כצפוי, ספקטרום ה-EPR של החלבון בתנאים שאינם LLPS שוחזר לחלוטין כאשר 1 M NaCl הוסף לתערובת (איור משלים. 4b).בסך הכל, הנתונים שלנו מצביעים על כך שהשינויים שזוהו על ידי CW-EPR משקפים בעיקר את האינטראקציה של אזור C-terminal של αS עם פוליקציות שונות בשלב המעובה, ונראה שהאינטראקציה הזו חזקה יותר עם pLK מאשר עם Tau.
על מנת לקבל מידע מבני נוסף על החלבונים ב-coacervate, החלטנו לחקור את מערכת LLPS באמצעות NMR בתמיסה.עם זאת, יכולנו לזהות רק את חלק ה- αS שנותר בשלב המפוזר, מה שעשוי לנבוע מדינמיקת חלבון מופחתת בתוך הקואצרבאט ושלב צפוף בתחתית התמיסה בניתוח NMR.כאשר ניתחנו את המבנה והדינמיקה של החלבון שנותר בשלב המפוזר של דגימת LLPS באמצעות NMR (איור משלים. 5c, d), שמנו לב שהחלבון התנהג כמעט זהה בנוכחות pLK ו- ΔNt-Tau, שניהם של שהיו במבנה משני ובדינמיקה של עמוד השדרה של החלבון, שנחשפו על ידי ניסויים על היסט כימי משני והרפיית R1ρ.נתוני NMR מראים שקצה ה-C של αS סובל מאובדן משמעותי של גמישות קונפורמציה תוך שמירה על אופיו הבלתי מסודר, כמו שאר רצף החלבון, בשל האינטראקציות שלו עם פוליקציות.
מכיוון שהרחבת אות CW-EPR שנצפה בשלב המעובה TEMPOL-122-αS משקפת את האינטראקציה של החלבון עם פוליקציות, ביצענו טיטרציה של EPR כדי להעריך את זיקת הקישור של αS לפוליקטונים שונים בהיעדר LLPS (ללא הצטברות של Buffer LLPS), המצביע על כך שהאינטראקציות זהות בשלבים מדוללים ומרוכזים (מה שאושר על ידי הנתונים שלנו, איור משלים 4a ואיור משלים 6).המטרה הייתה לראות אם כל הקואצרבטים, למרות תכונותיהם דמויות הנוזל השכיחות, מפגינים התנהגות דיפרנציאלית בסיסית ברמה המולקולרית.כצפוי, ספקטרום ה-EPR התרחב עם הגדלת ריכוז הפוליקטיון, המשקף ירידה בגמישות המולקולרית עקב אינטראקציות מולקולריות של כל שותפי האינטראקציה כמעט עד לרוויה (איור 3ה, איור משלים 6).pLK השיג את הרוויה הזו ביחס מולארי נמוך יותר (פוליקטיון:αS) בהשוואה ל-ΔNt-Tau ו-Tau441.למעשה, השוואה של הנתונים עם מודל קישור משוער בהנחה של n אתרי קישור זהים ובלתי תלויים הראתה שקבוע הדיסוציאציה לכאורה של pLK (~5 מיקרומטר) הוא בסדר גודל נמוך מזה של Tau441 או ΔNt-Tau (~50 מיקרומטר). ).µM).למרות שזו הערכה גסה, זה מצביע על כך של-αS יש זיקה גבוהה יותר לפוליקטונים פשוטים יותר עם אזורי מטען חיובי מתמשכים.בהתחשב בהבדל זה בזיקה בין αS לפוליקטונים שונים, שיערנו שתכונות הנוזל שלהם עשויות להשתנות בצורה שונה לאורך זמן ובכך לסבול מתהליכי LSPT שונים.
בהתחשב בסביבה הצפופה מאוד בתוך קואצרב החלבון ואופי העמילואיד של החלבון, צפינו בהתנהגות הקואצרבאט לאורך זמן כדי לזהות תהליכי LSPT אפשריים.באמצעות מיקרוסקופיה BF ו-CF (איור 4), ראינו ש-αS/Tau441 משתף במידה רבה בתמיסה, ויוצרות טיפות גדולות המגעות ומרטיבות את פני השטח בתחתית הבאר/המגלשה כטיפות מלאות, כצפוי (איור משלים). .7ד);אנו קוראים למבנים התחתונים הללו "רפסודות חלבון".מבנים אלה נותרו נוזלים שכן הם שמרו על יכולת היתוך (איור משלים. 7b) וניתן היה לראות אותם במשך מספר שעות לאחר הפעלת LLPS (איור 4 ואיור משלים. 7c).ראינו שתהליך ההרטבה מועדף על פני השטח של חומרים הידרופיליים ולא הידרופוביים (איור משלים. 7a), כצפוי עבור קואסרבטים אלקטרוסטטיים עם מטענים לא מאוזנים ולכן פוטנציאלים אלקטרוסטטיים גבוהים של פני השטח.יש לציין, התלכדות αS/ΔNt-Tau והרפטינג הופחתו באופן משמעותי, בעוד שהקונדנסטים של αS/pLK הופחתו באופן משמעותי (איור 4).במהלך זמן הדגירה הקצר, טיפות αS/pLK הצליחו להתלכד ולהרטיב את פני השטח ההידרופיליים, אך תהליך זה נעצר במהירות ולאחר 5 שעות של דגירה, נצפו רק אירועי התלכדות מוגבלים ולא הרטבה.– מעבר טפטוף ג'ל.
נציג BF (לוחות בגווני אפור) ו-CF (פאנלים ימין, AF488 שכותרתו αS בירוק) של דגימות קואצרבאט המכילות 100 מיקרומטר αS (1% תווית ניאון) במאגר LLPS בנוכחות 100 מיקרומטר Tau441 (עליון) תמונות פלואורסצנטיות מיקרוסקופיות ΔN -Tau (במרכז) או 1 מ"מ pLK (תחתית) בזמני דגירה שונים ובגובה מוקד (z, מרחק מהתחתית של הצלחת היטב).הניסויים חזרו על עצמם 4-6 פעמים ללא תלות זה בזה עם אותן תוצאות.αS/Tau441 coacervates מורטבים לאחר 24 שעות, ויוצרים רפסודות גדולות מהתמונה.סרגל קנה המידה עבור כל התמונות הוא 20 מיקרומטר.
לאחר מכן שאלנו אם מאגרי החלבון הגדולים דמויי הנוזל שנוצרו ב-αS/Tau441 LLPS יובילו לצבירה עמילואידית של כל אחד מהחלבונים שנחקרו.עקבנו אחר ההבשלה של טיפות αS/Tau441 לאורך זמן עם מיקרוסקופיה WF באותם תנאים כמו לעיל, אך באמצעות 1 מיקרומטר AF488 המסומן αS ו-Ato647N שכותרתו Tau441 (איור 5a).כצפוי, ראינו לוקליזציה מלאה של חלבון לאורך תהליך ההתבגרות.מעניין, מכ.לאחר 5 שעות, נצפו בתוך הרפסודות מבנים לא מעגליים עזים יותר, שכינינו "נקודות", שחלקם הועברו ב-αS, וחלקם הועשרו ב-Tau441 (איור 5a, חיצים לבנים).כתמים אלה תמיד נצפו בתוך רפסודות במידה רבה יותר עבור αS/ΔNt-Tau מאשר עבור αS/ΔNt-Tau.לא היו כתמים ברורים בטיפות של מערכות pLK ו-Tau שאינן מוכשרות לאיחוי/הרטבה.כדי לבדוק אם כתמים אלה המכילים αS ו-Tau441 הם אגרגטים דמויי עמילואיד, ביצענו ניסוי דומה באמצעות מיקרוסקופ CF שבו Tau441 סומן עם Atto647N ו-12.5 מיקרומטר תיופלבין-T (ThT) ספציפי לעמילואיד נוסף מההתחלה.צֶבַע.למרות שצביעת ThT של טיפות αS/Tau441 או רפסודות לא נצפה גם לאחר 24 שעות של דגירה (איור 5b, שורה עליונה - טיפות שנותרו מעל רפסודות חלבון), מבנים חיוביים ל-ThT המכילים Atto647N-Tau441 בתוך הרפסודות היו חלשים מאוד.זה משכפל את הגודל, הצורה והמיקום של הכתמים שתוארו קודם לכן (איור 5b, השורות האמצעיות והתחתונות), מה שמרמז על כך שהכתמים עשויים להתאים לצברים דמויי עמילואיד שנוצרו בקואסרבטים מזדקנים של נוזלים.
WF 25 מיקרומטר αS בזמני דגירה וגבהים שונים (z, מרחק מהתחתית הלא קשורה) בנוכחות 25 מיקרומטר Tau441 (1 מיקרומטר AF488 מסומן αS ו-Ato647N שכותרתו Tau441) בבאר של צלחת מיקרוסקופ עם חיץ LLPS) .שישה ניסויים חזרו על עצמם באופן עצמאי עם תוצאות דומות.b תמונה מיקרוסקופית CF של 25 מיקרומטר αS בנוכחות 25 מיקרומטר Tau441 (1 מיקרומטר Atto647N שכותרתו Tau441) ו-12.5 מיקרומטר thioflavin-T (ThT).טיפות חלבון משוקללות ורפסודות חלבון שהופקדו ונקודות מוצגות בשורות העליונות והאמצעיות, בהתאמה.השורה התחתונה מציגה תמונות של רפסודות וטיפות מ-3 שכפולים עצמאיים.חיצים לבנים מציינים נקודות ThT חיוביות בשני הלוחות.סרגל קנה המידה עבור כל התמונות הוא 20 מיקרומטר.
כדי לבחון ביתר פירוט את השינויים ברשת החלבון ה-coacervate במהלך המעבר מנוזל למוצק, השתמשנו בהדמיית חיים פלואורסצנטית (FLIM) ובמיקרוסקופיה של העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) (איור 6 ואיורים משלימים 8 ו-9).שיערנו שההתבגרות המשותפת של השכבה למבנה חלבון מצטבר דחוס יותר או אפילו דמוי מוצק מובילה למגע קרוב יותר בין החלבון לבין הגשושית הפלורסנטית המחוברת אליו, מה שעלול לייצר אפקט מרווה המתבטא בקיצור חיי בדיקה (τ) , כפי שתואר קודם40.,41 ,42.בנוסף, עבור דגימות עם תווית כפולה (AF488 ו-Atto647N כצבעי FRET תורם ומקבל, בהתאמה), ירידה זו ב-τ יכולה להיות מלווה גם בעיבוי coacervate ועלייה ביעילות FRET(E) במהלך LSPT.עקבנו אחר היווצרות רפסודה ונקודה לאורך זמן בדגימות LLPS αS/Tau441 ו-αS/ΔNt-Tau (25 מיקרומטר מכל חלבון במאגר LLPS המכיל 1 מיקרומטר AF488 המסומן αS ו/או Atto647N שסומן Tau441 או ΔNt-Tau).ראינו מגמה כללית בכך שאורך החיים של הקרינה של הבדיקות AF488 (τ488) ו-Atto647N (τ647N) ירד מעט ככל שהקואצרבטים התבגרו (איור 6 ואיור משלים 8c).מעניין ששינוי זה הוגבר משמעותית עבור נקודות בתוך רפסודות (איור 6c), מה שמעיד על כך שהתעבות חלבון נוספת התרחשה בנקודות.לתמיכה בכך, לא נצפה שינוי משמעותי בחיי הקרינה עבור טיפות αS/ΔNt-Tau שהתיישנו במשך 24 שעות (איור משלים. 8d), מה שמרמז על כך שג'ל טיפות הוא תהליך שונה מהכתמים ואינו מלווה בארגון מחדש מולקולרי משמעותי. בתוך coacervates.יש לציין כי לנקודות יש גדלים שונים ותוכן משתנה ב-αS, במיוחד עבור מערכת αS/Tau441 (איור משלים. 8e).הירידה בחיי הקרינה הנקודתית לוותה בעלייה בעוצמה, במיוחד עבור Atto647N המסומן Tau441 (איור משלים. 8a), ויעילות FRET גבוהה יותר עבור מערכות αS/Tau441 ו-αS/ΔNt-Tau, מה שמצביע על עיבוי נוסף ב-LLPS חמש שעות לאחר ההפעלה, החלבונים בתוך החשמל הסטטי התעבו.בהשוואה ל-αS/ΔNt-Tau, ראינו ערכי τ647N נמוכים יותר וערכי τ488 גבוהים במקצת בכתמי αS/Tau441, מלווים בערכי FRET נמוכים יותר ולא הומוגניים יותר.ייתכן שזה קשור לעובדה שבמערכת αS/Tau441, שפע ה-αS הנצפה והצפוי באגרגטים הוא הטרוגני יותר, לעיתים תת-סטוכיומטרי בהשוואה ל-Tau, שכן גם Tau441 עצמו עשוי לעבור LLPS והצטברות (איור משלים. 8e). .עם זאת, מידת התלכדות הטיפות, היווצרות רפסודות, וחשוב יותר, צבירת חלבונים בתוך קואסרבטים דמויי נוזל היא מקסימלית כאשר גם Tau441 וגם αS נמצאים.
תמונות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM) של αS/Tau441 ו-αS/ΔNt-Tau ב-25 מיקרומטר של כל חלבון (1 מיקרומטר AF488 שכותרתו αS ו-1 מיקרומטר Atto647N שכותרתו Tau441 או ΔNt PS-Tau).העמודות מציגות תמונות מייצגות של דגימות LLPS בזמני התבגרות שונים (30 דקות, 5 שעות ו-24 שעות).המסגרת האדומה מציגה את האזור המכיל כתמי αS/Tau441.תוחלת החיים מוצגת כפסים צבעוניים.סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר עבור כל התמונות.ב תמונת FLIM מוגדלת של האזור הנבחר, מוצגת בתיבה האדומה בחלונית א.טווחי חיים מוצגים באותו סולם צבעים כמו בלוח א.סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר.c היסטוגרמות המציגות AF488 (מחובר ל-αS) או Atto647N (מחובר ל-Tau) עבור מיני חלבונים שונים (טיפות-D-, raft-R- ו- speckle-P) שזוהו בתמונות FLIM שתועדו עבור התפלגות תזמון αS- במשך החיים של Tau441 ו αS/ΔNt-Tau מאחדים דגימות (N = 17-32 ROI עבור D, 29-44 ROI עבור R, ו-21-51 ROI עבור נקודות).ערכי ממוצע וחציון מוצגים כריבועים צהובים וקווים שחורים בתוך תיבות, בהתאמה.הגבול התחתון והעליון של התיבה מייצגים את הרבעון הראשון והשלישי, בהתאמה, והערכים המינימליים והמקסימליים בטווח הבין-רבעוני של פי 1.5 (IQR) מוצגים כשפם.חריגים מוצגים כיהלומים שחורים.מובהקות סטטיסטית בין זוגות של התפלגויות נקבעה באמצעות מבחן t דו מדגם, בהנחה של שונות לא שוות.ערכי p-מבחן דו-זנבתי מוצגים עם כוכביות עבור כל זוג נתונים השוואה (* ערך p > 0.01, ** ערך p > 0.001, *** ערך p > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns מצביע על זניחות (p-value > 0.05).ערכי ה-p המדויקים ניתנים בטבלה משלימה 1, והנתונים המקוריים מוצגים כקבצי נתונים גולמיים.
כדי להדגים עוד יותר את האופי הדומה לעמילואיד של כתמים/אגרגטים, טיפלנו בדגימות קואצרבטים לא מוכתמים במשך 24 שעות עם ריכוזים גבוהים של (1 M) NaCl, מה שהביא להפרדה של אגרגטים מקואסרבטים חלבונים.כאשר נצפו אגרגטים מבודדים (כלומר, תמיסה מפוזרת של אגרגטים) באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM), צפינו במורפולוגיה כדורית בעיקרה עם גובה קבוע של כ-15 ננומטר, אשר נוטה להתאגד בתנאים של ריכוז מלח גבוה, בדומה ל- ההתנהגות של סיבים עמילואידים טיפוסיים עקב ההשפעה ההידרופוביה החזקה על פני השטח (שימו לב שלסיביים יש בדרך כלל גובה של ~10 ננומטר) (איור משלים. 10a).מעניין, כאשר אגרגטים מבודדים הודגרו עם ThT במבחן קרינה ThT סטנדרטי, ראינו עלייה דרמטית בתפוקה הקוונטית של הקרינה ThT, דומה לזו שנצפתה כאשר הצבע הודגר עם סיבים טיפוסיים של עמילואיד αS (איור משלים. 10b), מה שמרמז על כך ש אגרגטים הקואצרבטים מכילים מבנים דמויי עמילואיד..למעשה, האגרגטים היו סובלניים לריכוזי מלחים גבוהים אך רגישים ל-4 M גואנידין כלוריד (GdnHCl), כמו סיבים טיפוסיים של עמילואיד (איור משלים. 10c).
לאחר מכן, ניתחנו את הרכב האגרגטים באמצעות פלואורסצנטי מולקולה בודדת, ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי/מתאם צולב (FCS/FCCS) וניתוח פרץ של זיהוי צירוף מקרים של שני צבעים (TCCD).לשם כך, בודדנו אגרגטים שנוצרו לאחר 24 שעות של דגירה בדגימות LLPS של 100 μl המכילות αS ו-Tau441 (שניהם 25 מיקרומטר) יחד עם 1 מיקרומטר AF488 מסומן αS ו-1 מיקרומטר Atto647N שכותרתו Tau4441.יש לדלל את תמיסת האגרגט המפוזר שהתקבל למצב מונומולקולרי באמצעות אותו חיץ נטול PEG ו-1 M NaCl (אותו חיץ המשמש להפרדת אגרגטים מקואצרבאט) כדי למנוע אינטראקציות אלקטרוסטטיות אפשריות בין LLPS לחלבון.דוגמה למסלול הזמן של מולקולה בודדת ניתן לראות באיור 7a.ניתוח FCCS/FCS (קורלציה צולבת, CC ואוטוקורלציה, AC) הראה כי אגרגטים המכילים αS ו-tau היו בשפע בדגימות (ראה עקומת CC באיור 7b, לוח שמאל), ועודף של חלבון מונומרי שיורי התעורר כ תוצאה של תהליך הדילול (ראה עקומות AC באיור 7b, לוח שמאל).ניסויי בקרה שבוצעו באותם תנאי תמיסה תוך שימוש בדגימות המכילות חלבונים מונומריים בלבד לא הראו עקומות CC, ועיקומי ה-AC מתאימים היטב למודל הדיפוזיה החד-רכיבי (משוואה 4), שבו לחלבונים מונומריים יש את מקדמי הדיפוזיה הצפויים (איור 7b) ), לוח ימין).מקדם הדיפוזיה של חלקיקים מצטברים הוא פחות מ-1 µm2/s, ושל חלבונים מונומריים הוא בערך 1 µm2/s.50–100 מיקרומטר/שנייה;הערכים דומים לערכים שפורסמו בעבר עבור סיני αS עמילואיד ו- αS מונומרי בנפרד בתנאי פתרון דומים44.כאשר ניתחנו את האגרגטים עם ניתוח פיצוץ TCCD (איור 7c, לוח עליון), מצאנו שבכל אגרגט מבודד (αS/Tau heteroaggregate), כ-60% מהאגרגטים שזוהו הכילו גם αS וגם tau, כ-30% הכילו רק tau, כ-10% αS בלבד.ניתוח סטוכיומטרי של הטרואגרגטים αS/Tau הראה שרוב ההטרואגרגטים הועשרו בטאו (סטוכיומטריה מתחת ל-0.5, המספר הממוצע של מולקולות טאו למצרף הוא פי 4 יותר ממולקולות αS), מה שעולה בקנה אחד עם העבודה שלנו שנצפתה ב-FLIM באתרו ניסויים..ניתוח FRET הראה כי אגרגטים אלו הכילו את שני החלבונים, אם כי לערכי ה-FRET בפועל במקרה זה אין חשיבות רבה, שכן התפלגות הפלואורופורים בכל אגרגט הייתה אקראית עקב עודף של חלבון לא מסומן ששימש בניסוי.מעניין, כאשר ביצענו את אותו ניתוח באמצעות וריאנט טאו חסר צבירה עמילואיד בוגר 45,46 (ראה איור משלים. 11a,b), שמנו לב שלמרות שהצבירה האלקטרוסטטית של αS הייתה זהה (איור משלים. 11c, d), היכולת ליצור אגרגטים בתוך ה-coacervate הופחתה באופן דרסטי ו-FLIM זיהה מספר כתמים בניסויים באתרו, ונצפו עקומות חלשות של מתאם צולב עבור דגימות מצטבר מבודדות.עם זאת, עבור מספר קטן של אגרגטים שזוהו (רק עשירית מ-Tau441), ראינו שכל אגרגט מועשר ב-αS מאשר בגרסה זו של Tau, כאשר כ-50% מהאגרגטים שזוהו מכילים רק מולקולות αS, ו-αS היה הטרוגני בעודף .אגרגטים (ראה איור משלים. 11e), בניגוד לאגרגטים ההטרוגניים שנוצרו על ידי Tau441 (איור 6f).התוצאות של ניסויים אלה הראו שלמרות ש-αS עצמו מסוגל להצטבר עם טאו בתוך הקואצרבאט, גרעין טאו נוח יותר בתנאים אלה, והאגרגטים דמויי העמילואיד המתקבלים מסוגלים לפעול כצורה של αS וטאו.עם זאת, ברגע שנוצרת ליבה עשירה בטאו, אינטראקציות הטרוטיפיות בין αS וטאו מועדפות במצטברים על פני אינטראקציות הומוטיפיות בין מולקולות טאו;אנו גם צופים ברשתות חלבון בקואצרבטים נוזליים של αS/tau.
עקבות זמניים של פלואורסצנציה מייצגת של מולקולות בודדות של אגרגטים מבודדים שנוצרו ב-αS/Tau441 coacervates אלקטרוסטטיים.התפרצויות התואמות לקואגרגטים αS/Tau441 (התפרצויות מעל הסף המצוין) נצפו בשלושה ערוצי זיהוי (פליטת AF488 ו-Ato647N לאחר עירור ישיר, קווים כחולים ואדומים, פליטת Atto647N לאחר עירור עקיף), FRET, קו סגול).בניתוח FCS/FCCS של דגימה של אגרגטים αS/Tau441 מבודדים שהתקבלו מ-LLPS (פאנל שמאל).עקומות קורלציה אוטומטית (AC) עבור AF488 ו-Atto647N מוצגות בכחול ובאדום, בהתאמה, ועקומות מתאם צולב (CC) הקשורים לאגרגטים המכילים את שני הצבעים מוצגות בסגול.עקומות ה-AC משקפות את נוכחותם של מיני חלבונים מונומריים ומצטברים מסומנים, בעוד שעקומות ה-CC מציגות רק דיפוזיה של אגרגטים מסומנים כפולים.אותו ניתוח, אך באותם תנאי תמיסה כמו בנקודות מבודדות, דגימות המכילות רק αS מונומרי ו-Tau441 מוצגות כפקדים בלוח הימני.c ניתוח הבזק פלואורסצנטי של מולקולות בודדות של אגרגטים מבודדים שנוצרו בקואצרבטים אלקטרוסטטיים αS/Tau441.מידע עבור כל אגרגט שנמצא בארבע חזרות שונות (N = 152) משורטט כנגד הסטוכיומטריה, ערכי S ויעילות FRET שלהם (פאנל עליון, פס צבעוני משקף את ההתרחשות).ניתן להבחין בין שלושה סוגים של אגרגטים: אגרגטים -αS בלבד עם S~1 ו-FRET~0, אגרגטים בלבד עם S~0 ו-FRET~1, ואגרגטים הטרוגניים של Tau/αS עם S~1 ו-FRET אומדנים של הכמות. של שני חלבוני הסמן שזוהו בכל אגרגט הטרוגני (N = 100) מוצגים בלוח התחתון (סקאלת הצבעים משקפת את ההתרחשות).נתונים גולמיים מסופקים בצורה של קבצי נתונים גולמיים.
ההבשלה או ההזדקנות של עיבוי חלבון נוזלי למבנים דמויי ג'ל או מוצקים לאורך זמן דווחו כמעורבים במספר פונקציות פיזיולוגיות של הקונדנסט47 וכן במחלה, כתהליך לא תקין שקדם לצבירה עמילואיד 7, 48, 49. כאן אנו לומדים הפרדת שלבים והתנהגות בפירוט.LSPT αS בנוכחות פוליקציות אקראיות בסביבה מבוקרת בריכוזים מיקרומולריים נמוכים ובתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית (שים לב שהריכוז הפיזיולוגי המחושב של αS הוא > 1 µM50), בעקבות התנהגות תרמודינמית אופיינית של LPS.מצאנו כי αS, המכיל אזור C-terminal בעל מטען שלילי מאוד ב-pH פיזיולוגי, מסוגל ליצור טיפות עשירות בחלבון בתמיסה מימית באמצעות LLPS בנוכחות פפטידים מופרעים מאוד קטיוניים כגון pLK או Tau בתהליך של אלקטרוסטטי. עיבוי מורכב בנוכחות מקרומולקולות צבירה.לתהליך זה עשויות להיות השפעות רלוונטיות בסביבה התאית שבה αS פוגש מולקולות פוליקציוניות שונות הקשורות לצבירה הקשורה למחלה הן במבחנה והן ב-vivo51,52,53,54.
במחקרים רבים, דינמיקת חלבון בתוך טיפות נחשבה לאחד מגורמי המפתח הקובעים את תהליך ההתבגרות55,56.ב-αS coacervates אלקטרוסטטיים עם פוליקציות, תהליך ההבשלה תלוי ככל הנראה בחוזק האינטראקציות עם פוליקציות, בערכיות ובריבוי של אינטראקציות אלו.תיאוריית שיווי המשקל מציעה שנוף שיווי משקל של שני מצבים נוזליים יהיה נוכחות של טיפה גדולה עשירה בביופולימרים המניעים LLPS57,58.ניתן להשיג צמיחת טיפות על ידי התבגרות אוסטוולד59, התאחדות60 או צריכה של מונומר חופשי בשלב המפוזר61.עבור αS ו-Tau441, ΔNt-Tau או pLK, רוב החלבון היה מרוכז בקונדנסט בתנאים המשמשים במחקר זה.עם זאת, בעוד שטיפות טאו בגודל מלא התלכדו במהירות עם הרטבת פני השטח, התלכדות טיפות והרטבה היו קשות עבור ΔNt-Tau ו-pLK, מה שמרמז על אובדן מהיר של תכונות נוזל בשתי המערכות הללו.על פי ניתוח FLIM-FRET שלנו, טיפות ה-pLK וה- ΔNt-Tau המיושנות הראו מידה דומה של צבירת חלבון (משך חיים דומה של הקרינה) כמו הטיפות המקוריות, מה שמרמז על כך שרשת החלבון המקורית נשמרה, אם כי נוקשה יותר.
אנו עושים רציונליזציה של תוצאות הניסוי שלנו במודל הבא (איור 8).הטיפות שנוצרו באופן זמני בתחילה הן לרוב רשתות חלבון ללא פיצוי אלקטרוסטטי, ולכן ישנם אזורים של חוסר איזון מטען, במיוחד בממשק הטיפות, וכתוצאה מכך לטיפות בעלות פוטנציאל משטח אלקטרוסטטי גבוה.כדי לפצות על המטען (תופעה המכונה בדרך כלל דלדול ערכיות) ולמזער את פוטנציאל פני השטח של הטיפות, הטיפות יכולות לכלול פוליפפטידים חדשים מהשלב המדולל, לארגן מחדש רשתות חלבון כדי לייעל אינטראקציות מטען-מטען ולקיים אינטראקציה עם טיפות אחרות.עם משטחים (הרטבה).נראה כי טיפות αS/pLK, בשל רשת החלבון הפשוטה יותר שלהן (רק אינטראקציות הטרוטיפיות בין αS ו-pLK) וזיקה גדולה יותר לאינטראקציות חלבון-חלבון, מסוגלות לאזן את המטען של העיבוי מהר יותר;ואכן, ראינו קינטיקה חלבונית מהירה יותר בקואסרבטים של αS/pLK שנוצרו בתחילה מאשר ב-αS/Tau.לאחר דלדול הערכיות, האינטראקציות הופכות פחות ארעיות והטיפות מאבדות את תכונותיהן הנוזליות והופכות לטיפות דמויות ג'ל, לא דליקות בעלות פוטנציאל משטח אלקטרוסטטי נמוך (ולכן אינן מסוגלות להרטיב את המשטח).לעומת זאת, טיפות αS/Tau פחות יעילות באופטימיזציה של איזון מטען טיפות בשל רשתות חלבון מורכבות יותר (עם אינטראקציות הומוטיפיות והטרוטיפיות כאחד) והאופי החלש יותר של אינטראקציות חלבון.זה מביא לטיפות ששומרות על התנהגות נוזלים לפרקי זמן ממושכים ומציגות פוטנציאל משטח אלקטרוסטטי גבוה שנוטה להיות ממוזער על ידי התלכדות וגדילה (ובכך ממזער את יחס שטח הפנים/נפח של הטיפות) ועל ידי הרטבת כימי השטח ההידרופיליים.זה יוצר ספריות חלבון מרוכזות גדולות השומרות על תכונות נוזלים שכן האינטראקציות נשארות חולפות מאוד עקב החיפוש המתמיד אחר אופטימיזציה של מטען ברשת החלבון.מעניין, צורות קטומות N-טרמינלי של טאו, כולל כמה איזופורמים המופיעים באופן טבעי62, מפגינות התנהגות ביניים, כאשר חלק מהקואסרבטים מזדקנים עם αS לטיפות דמויות ג'ל ארוכות חיים, בעוד שאחרים הופכים לעיבוי נוזלי גדול.דואליות זו בהתבגרות של קואצרבטים אלקטרוסטטיים של αS תואמת מחקרים תיאורטיים וניסיוניים של LLPS עדכניים אשר זיהו מתאם בין דלדול ערכיות לבין סינון אלקטרוסטטי בקונדנסטים כמפתח לשליטה בגודל הקונדנסט ותכונות הנוזל.מנגנון 58.61.
סכימה זו מציגה את מסלול צבירת העמילואיד המשוער עבור αS ו-Tau441 באמצעות LLPS ו-LSPT.עם אזורים נוספים עשירים באניונים (אדומים) ועשירים בקטונים (כחול), לקואצרבטים אלקטרוסטטיים αS ו-tau עם ערכיות מספקת יש אנרגיית פני השטח נמוכה יותר ולכן פחות התאחדות, וכתוצאה מכך להזדקנות מהירה של טיפות.מושג מצב ג'ל יציב שאינו מצטבר..מצב זה נוח מאוד במקרה של מערכת αS/pLK בשל הזיקה הגבוהה שלה ורשת האינטראקציה הפשוטה יותר של זוג חלבון, המאפשרת מעבר מהיר דמוי ג'ל.להיפך, טיפות בעלות ערכיות לא מספקת, ולפיכך, אזורים טעוני חלבון הזמינים לאינטראקציה, מקלים על הקואסרבט להתמזג ולהרטיב את פני השטח ההידרופיליים כדי להפחית את אנרגיית פני השטח הגבוהה שלו.מצב זה עדיף עבור coacervates של αS/Tau441, שיש להם רשת מורכבת רב-ערבית המורכבת מאינטראקציות חלשות של טאו-טאו ו-αS-טאו.בתורו, קואצרבטים גדולים יותר ישמרו בקלות רבה יותר על תכונותיהם הדומות לנוזל, ויאפשרו אינטראקציות אחרות בין חלבון לחלבון להתרחש.בסופו של דבר, נוצרים אגרגטים הטרוגניים עמילואידים המכילים הן αS והן טאו בתוך נוזל הקואסרבט, אשר עשוי להיות קשור לאלו שנמצאו בגופי הכללה, שהם סימני היכר של מחלות ניווניות עצביות.
המבנים הגדולים דמויי הנוזל שנוצרו במהלך הבשלת αS/Tau441 עם סביבת חלבון צפופה מאוד אך דינמית, ובמידה פחותה, αS/ΔNt-Tau coacervates הם מאגרים אידיאליים ליצירת גרעין של צבירה חלבון.אכן צפינו ביצירת אגרגטים של חלבון מוצק בסוג זה של קואסרבטים של חלבון, המכילים לעתים קרובות גם αS וגם טאו.הראינו שהטרואגרגטים אלה מיוצבים על ידי אינטראקציות לא אלקטרוסטטיות, מסוגלים לקשור צבעי ThT הספציפיים לעמילואיד באותו אופן כמו סיבים טיפוסיים של עמילואיד, ואכן יש להם עמידות דומה להשפעות שונות.אגרגטים αS/tau שנוצרו על ידי LLPS הוכחו כבעלי תכונות דמויות עמילואיד.ואכן, הווריאציה הבוגרת של Tau החסרה בהצטברות עמילואיד פגועה משמעותית ביצירת אגרגטים הטרוגניים אלו של αS בתוך הקואצרבאט האלקטרוסטטי הנוזלי.היווצרות של אגרגטים αS/Tau441 נצפתה רק בתוך הקואסרבטים, ששמרו על תכונות דמויות נוזל, ולעולם לא, אם הקואצרבטים/טיפות לא הגיעו למצב הג'ל.במקרה האחרון, החוזק המוגבר של אינטראקציות אלקטרוסטטיות וכתוצאה מכך הנוקשות של רשת החלבונים מונעים את הסידורים הקונפורמטיביים ההכרחיים של חלבונים כדי ליצור אינטראקציות חלבון חדשות הנחוצות לגרעין עמילואיד.עם זאת, ניתן להשיג זאת בקואסרבטים גמישים יותר, דמויי נוזל, אשר בתורם נוטים יותר להישאר נוזליים ככל שהם גדלים בגודלם.
העובדה שיצירת אגרגטים בתוך הפאזה המעובה עדיפה בקונדנסטים גדולים של αS/Tau מאשר בטיפות קטנות שמתגבשות במהירות, מדגישה את הרלוונטיות של זיהוי הגורמים השולטים בהתאחדות הטיפות.לפיכך, לא רק שיש נטייה להפרדת פאזות, אלא יש לשלוט בגודל הקונדנסט לתפקוד תקין וכן למניעת מחלות58,61.התוצאות שלנו גם מדגישות את החשיבות של האיזון בין LLPS ו-LSPT עבור מערכת αS/Tau.בעוד שהיווצרות טיפות עשויה להגן מפני צבירה עמילואידית על ידי הפחתת כמות מונומרי החלבון הזמינים בתנאי רוויה, כפי שהוצע במערכות אחרות63,64, היתוך טיפות ברמות טיפות גבוהות עשוי להוביל לצבירה פנימית של חלבון באמצעות סידורים קונפורמטיביים איטיים.רשתות חלבון..
בסך הכל, הנתונים שלנו מדגישים מאוד את הרלוונטיות של ערכיות מלוכדת ואינטראקציות מרוצות/לא מרוצות ברשתות ירידה בהקשר של LSPT.בפרט, אנו מראים כי קונדנסטים של αS/Tau441 באורך מלא מסוגלים להתמזג ביעילות וליצור גרעין ליצירת הטרואגרגטים דמויי עמילואיד הכוללים שני חלבונים ומציעים מנגנון מולקולרי המבוסס על תוצאות הניסוי שלנו.ההצטברות המשותפת של שני חלבונים ב-aS/Tau coacervate נוזלי שעליה אנו מדווחים כאן עשויה אכן להיות קשורה לשיתוף-לוקליזציה של שני חלבונים בתכלילים, שהם סימני ההיכר של המחלה, ועשויה לתרום להבנת הקשר בין LLPS לבין צבירת עמילואיד, סוללת את הדרך ל-IDP טעון מאוד בניוון עצבי.
וריאנטים מונומריים של WT-αS, ציסטאין (Q24C-αS, N122C-αS) ו-ΔCt-αS (Δ101-140) באו לידי ביטוי ב-E. coli וטוהרו כמתואר קודם לכן.5 mM DTT נכלל בכל השלבים בטיהור של מוטציות αS ציסטאין למניעת היווצרות קשר דיסולפיד.איזופורם Tau441 (פלסמיד המתקבל מ-Addgene #16316), וריאנט ΔNt-Tau (Δ1-150, המתקבל על ידי שיבוט IVA עם פריימרים CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) ו-AggDef-1CT וריאנט מטוהר עם וריאנט AggDef-1CT,5CT עם 3AggDef-1CT. תרבויות קולי היו גדל ל-OD600 = 0.6-0.7 ב-37°C ו-180 סל"ד, והביטוי הושרה עם IPTG למשך 3 שעות ב-37°C.קציר תאים ב-11,500 xg למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ושטוף עם חיץ מלוחים המכיל 150 מ"מ NaCl.השהה מחדש את הכדור במאגר תמוגה (20 מ"ל לכל 1 ליטר LB: MES 20 מ"מ, pH 6.8, NaCl 500 מ"מ, EDTA 1 מ"מ, MgCl2 0.2 מ"מ, DTT 5 מ"מ, PMSF 1 מ"מ, בנזמידין 50 מיקרומטר, קופפטין 100).שלב הסוניציה בוצע על קרח עם משרעת של 80% במשך 10 פולסים (דקה הפעלה, דקה כיבוי).אל תחרוג מ-60 מ"ל באולטרסאונד אחד.ליזטים של E. coli חוממו ב-95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן צוננו על קרח וצנטריפוגה ב-127,000×g למשך 40 דקות.הסופרנטנט המובהר הוחל על ממברנה של 3.5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, בריטניה) ועבר דיאליזה כנגד 4 ליטר של חיץ דיאליזה (20 מ"מ MES, pH 6.8, NaCl 50 מ"מ, EDTA 1 מ"מ, MgCl2 2 מ"מ, DTT 2 מ"מ , PMSF 0.1 mM) למשך 10 שעות.עמודה של 5 מ"ל לחילופי קטונים (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, ארה"ב) עברה איזון עם חיץ שיווי משקל (20 מ"מ MES, pH 6.8, 50 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, 2 מ"מ MgCl2, 2 מ"מ DTT, 0.1 מ"מ PMSF).ה-tau lysate סונן דרך מסנן PVDF 0.22 מיקרומטר והוחדר לעמודה בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה.ההחלפה בוצעה בהדרגה, טאו נפלטה עם 15-30% חיץ חלוקה (20 מ"מ MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 מ"מ EDTA, 2 מ"מ MgCl2, 2 מ"מ DTT, 0.1 מ"מ PMSF).שברים נותחו על ידי SDS-PAGE, וכל השברים המכילים פס אחד עם המשקל המולקולרי הצפוי של טאו רוכזו באמצעות מסנן צנטריפוגה של 10 kDa והוחלפו במאגר המכיל 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ו-DTT 2 mM עבור ריכוז החלבון הסופי היה 100 מיקרומטר.לאחר מכן, תמיסת החלבון הועברה דרך מסנן PVDF בגודל 0.22 מיקרומטר, הוקפאה במהירות ואוחסנה ב-80 מעלות צלזיוס.חלבון K18 ניתן בחביבות על ידי פרופ' אלברטו בופי.טוהר התכשיר היה מעל 95% כפי שאושר על ידי SDS-PAGE ו-MALDI-TOF/TOF.ציסטינים שונים סומנו כימית עם AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) או TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, טורונטו, קנדה).אושרו על ידי ספיגה ו-MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ו-K18 סומנו עם שאריות ציסטאין מקוריות בעמדות 191 ו-322 באמצעות Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, גרמניה) בעקבות אותו הליך.מפות מטען נטו לכל שאריות עבור αS ו-Tau441 נוצרו באמצעות CIDER66.
פולי-L-ליזין מוצק (pLK DP 90-110 לפי NMR מהספק, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, אלבמה, ארה"ב) הומס ב-10 מ"מ HEPES, 100 מ"מ NaCl, pH 7.4 עד 10 מ"מ ריכוז, תהליך חילול עבור 5 דקות באמבט מים קולי ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, ארה"ב) ו-FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, ארה"ב) מסיסים במים ומופצים באופן נרחב במאגר LLPS.דיאליזה מסירה מלחים מזהמים.לאחר מכן הם סוננו דרך מסנן מזרק עם גודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר, וריכוזיהם חושבו באמצעות רפרקטומטר (מטלר טולדו, קולומבוס, אוהיו, ארה"ב).דגימות LLPS הוכנו בטמפרטורת החדר בסדר הבא: חיץ ושחול היו מעורבבים ו-1 mM tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) חומצה טטראצטית (EDTA, carboxynth) ותערובת של 1% מעכבי פרוטאז (PMSF 100 mM, בנזימיד 1 mM, leupeptin 5 μM).לאחר מכן מוסיפים αS ופוליקטונים מאוחדים (אפשרויות pLK או Tau).עבור ניסויים בסדרות זמן של thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, בריטניה), השתמש בריכוז ה-ThT הכולל להיות מחצית מריכוז αS.ערבבו בעדינות אך ביסודיות את הדגימות כדי להבטיח שהן הומוגניות.הריכוז של כל רכיב השתנה מניסוי לניסוי, כמתואר בסעיף התוצאות.נעשה שימוש באזיד בריכוז של 0.02% (w/v) בכל פעם שמשך הניסוי עלה על 4 שעות.עבור כל הניתוחים באמצעות דגימות LLPS, אפשר לתערובת להתאזן במשך 5 דקות לפני הניתוח.לצורך ניתוח פיזור אור, 150 μl של דגימות הועמסו על גבי משטחי 96-בארים לא מחייבים (µClear®, שחור, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, אוסטריה) וכוסו בסרט דבק.LLPs נוטרו על ידי מדידת ספיגה ב-350 ננומטר במרכז התמיסה בקורא לוחות CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, גרמניה).הניסויים בוצעו בשלושה עותקים ב-25 מעלות צלזיוס, והשגיאות חושבו כסטיית התקן מהממוצע.השלב המדולל הוכמת על ידי צנטריפוגה מדגימה וניתוח ג'ל SDS-PAGE, ושבריר αS בשלבים המדולל והמרוכז כמת בתמיסות LLPS שונות.דגימת 100 μl LLPS המכילה 1 מיקרומטר AF488 המסומן αS הוכנה על ידי ערבוב יסודי ואחריו צנטריפוגה ב-9600×g למשך 30 דקות, ולאחר מכן המשקע היה נראה בדרך כלל.50 μl העליון של הסופרנטנט שימש לכימות חלבון באמצעות ג'ל SDS-PAGE.ג'לים נסרקו עם מסנני AF488 באמצעות מערכת הדמיית ג'ל ChemiDoc (מעבדות ביו-ראד, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב) או נצבעו בכתם Coomassie והוצגו באמצעות מסננים מתאימים.הרצועות שהתקבלו נותחו באמצעות ImageJ גרסה 1.53i (המכונים הלאומיים לבריאות, ארה"ב).הניסויים בוצעו בכפולות בשני ניסויים שונים עם תוצאות דומות.
בדרך כלל, 150 μl של דגימות יושמו על מיקרופלטות 96-בארות לא מחייבות והוצגו בטמפרטורת החדר במיקרוסקופ הפוך Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה).עבור ניסויים נקודתיים, נעשה שימוש גם בצלחות µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, גרמניה) או במיקרו-צלחות פוליסטירן עם 96 בארות (Corning Costar Corp., Acton, מסצ'וסטס).מנורות הלוגן או כספית EL6000 שימשו כמקורות תאורה (להדמיית BF/DIC ו-WF, בהתאמה).עבור מיקרוסקופיה WF, נעשה שימוש באובייקט אוויר בהגדלה של פי 40 (Leica Microsystems, גרמניה) כדי למקד את האור בדגימה ולאסוף אותה.עבור דגימות המסומנות AF488 ו-ThT, מסננים עירור ופליטת מסננים עם ערכות מסנני GFP סטנדרטיות, מסנני עירור ופליטת פס-פס, בהתאמה, מסנני פס-פס של 460-500 ננומטר ו-512-542 ננומטר, ומראה דיכרואית של 495 ננומטר.עבור דגימות שסומנו ב-Atto647N, נעשה שימוש בסט סטנדרטי של מסנני Cy5 עם מסנני פס-עירור ופליטת פליטה 628-40 ננומטר ו-692-40 ננומטר, בהתאמה, ומראה דיכרואית של 660 ננומטר.עבור מיקרוסקופיה BF ו-DIC, השתמש באותה מטרה לאיסוף אור מוחזר.האור שנאסף תועד במצלמת Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, גרמניה).זמן החשיפה היה 50 אלפיות השנייה עבור הדמיית מיקרוסקופיה BF ו-DIC ו-20-100 שניות עבור הדמיית מיקרוסקופיה WF.לשם השוואה, זמן החשיפה עבור כל הניסויים עם ThT היה 100 אלפיות השנייה.ניסויי זמן-lapse בוצעו כדי לדמיין התלכדות טיפות, כאשר תמונות נאספו כל 100 אלפיות השנייה למשך מספר דקות.ImageJ (NIH, ארה"ב) שימש לניתוח תמונה.הניסויים בוצעו בשלושה עותקים עם תוצאות דומות.
עבור ניסויי colocalization, FRAP ושחזור 3D, תמונות נרכשו במיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך של Zeiss LSM 880 באמצעות מהדורת ZEN 2 כחולה (Carl Zeiss AG, Oberkochen, גרמניה).דגימות של 50 μl יושמו על צלחות פטרי µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, גרמניה), טופלו בפולימר הידרופילי (ibiTreat) והותקנה במטרת טבילת שמן 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) ב-DIC).תמונות נרכשו באמצעות קווי לייזר של 458 ננומטר, 488 ננומטר ו-633 ננומטר עם רזולוציה של 0.26 מיקרומטר/פיקסל וזמן חשיפה של 8 מיקרומטר/פיקסל לחלונות זיהוי עירור ופליטות של 470-600 ננומטר, 493-628 ננומטר, 493-628 ננומטר. ו-638-755 ננומטר שימשו להמחשת ThT, AF488 ו-Atto647N, בהתאמה.עבור ניסויי ה-FRAP, צילום זמן-lapse של כל דגימה תועד בפריים אחד לשנייה.הניסויים בוצעו בשלושה עותקים בטמפרטורת החדר עם תוצאות דומות.כל התמונות נותחו באמצעות תוכנת Zen 2 Blue Edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, גרמניה).עקומות FRAP נורמלו, שורטטו והותאמו לנתוני עוצמה/זמן שחולצו מתמונות באמצעות Zen 2 באמצעות OriginPro 9.1.עקומות ההתאוששות הותאמו למודל מונו-אקספוננציאלי כדי להסביר דיפוזיה מולקולרית עם מונח אקספוננציאלי נוסף כדי להסביר את אפקט הלבנת הרכישה.לאחר מכן חישבנו את D תוך שימוש ברדיוס ההלבנה הנומינלי ובזמן מחצית החיים של ההתאוששות שנקבעו קודם לכן, כמו במשוואה של Kang et al.5 35 מוצג.
גרסאות ציסטאין בודדות של αS סונתזו עם 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) בעמדות 24 (TEMPOL-24-αS) ו-122 (TEMPOL-122-αS), בהתאמה.תיוג ספין עבור ניסויי EPR, ריכוז αS נקבע על 100 מיקרומטר וריכוז PEG היה 15% (w/v).עבור תנאי צבירה שונים, יחס αS:pLK היה 1:10, בעוד היחסים αS:ΔNt-Tau ו-αS:Tau441 נשמרו על 1:1.עבור ניסויי טיטרציה מחייבים בהיעדר צפיפות, TEMPOL-122-αS נשמר ב-50 מיקרומטר ופוליקטציות עברו טיטרציה בריכוזים הולכים וגדלים, תוך הכנת כל מצב בנפרד.מדידות CW-EPR בוצעו באמצעות ספקטרומטר Bruker ELEXSYS E580 X-band מצויד במהוד Bruker ER4118 SPT-N1 הפועל בתדר מיקרוגל (SHF) של ~9.7 GHz.הטמפרטורה נקבעה ל-25 מעלות צלזיוס ונשלטת על ידי קריוסטט חנקן נוזלי.הספקטרום התקבלו בתנאים בלתי רוויים בהספק MW של 4 mW, משרעת אפנון של 0.1 mT ותדר אפנון של 100 קילו-הרץ.עוצמות ספקטרליות נורמלו כדי למנוע הבדלים בריכוזי ספין בין דגימות והפחתת ספין אפשרית עקב ריכוזים שיוריים של חומרים מפחיתים בדגימות המכילות Tau441 או ΔNt-Tau (הנוכחים בתמיסות החלבון המקוריות).הערכים הנתונים של g התקבלו כתוצאה ממודל ספקטרלי EPR שבוצע באמצעות תוכנת Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) המיושמת ב- Matlab®67.מודלים איזוטרופיים של רכיב אחד/שני שימשו למודל הנתונים.לאחר נרמול כל האותות, השאריות חושבו על ידי הפחתת כל סימולציה מהספקטרום הניסיוני המתאים.עבור ניתוח טיטרציה מחייב, נעשה שימוש בעוצמה היחסית של הלהקה השלישית ללהקה השנייה של ספקטרום ה-EPR המנורמל (IIII/III) לניטור הקישור של פוליקציות ל-αS.כדי להעריך את קבוע הדיסוציאציה (Kd), העקומה שהתקבלה הותאמה למודל משוער בהנחה של n אתרי קישור זהים ובלתי תלויים.
ניסויי ספקטרוסקופיה של NMR בוצעו באמצעות ספקטרומטר NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) מצויד ב-cryoprobe ו-Z-gradient.כל הניסויים בוצעו תוך שימוש ב-130-207 µM αS ובמקבילים αS/ΔNt-Tau ו-pLK ב-10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ובוצעו ב-15°C.כדי לנטר LPS על ידי NMR, נוספו 10% PEG לדגימות המעורבבות מראש.חלקת ההפרעות של המשמרת הכימית (איור 1b) מציגה את השינויים הכימיים הממוצעים של 1H ו-15N.ספקטרום αS 2D1H-15N HSQC הוקצו על סמך הקצאה קודמת (ערך BMRB מס' 25227) ואושרו על ידי הקלטה וניתוח הספקטרום התלת מימדי של HNCA, HNCO ו-CBCAcoNH.שינויים כימיים 13Cα ו-13Cβ חושבו בנוכחות ΔNt-Tau או pLK כדי למדוד שינויים אפשריים במגמות המבנה המשני בהשוואה להזמרות כימיות αS בקונפורמציה אקראית טהורה של סליל 68 (איור משלים 5c).קצבי R1ρ נמדדו על ידי הקלטת ניסויי hsqctretf3gpsi (שהושגו מספריית Bruker) עם עיכובים של 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 ו-800 אלפיות השנייה, והפונקציות המעריכיות הותאמו לעיכובים שונים בעצימות השיא. פעמים לקביעת ה-R1ρ ואי הוודאות הניסויית שלו.
ניסויים במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם פתרון זמן בשני צבעים בוצעו במיקרוסקופ קונפוקאלי פלואורסצנטי MT200 מסחרי עם פתרון זמן (PicoQuant, ברלין, גרמניה) עם מכשיר ספירת פוטון בודד (TCSPC) בקורלציה בזמן.ראש דיודת הלייזר משמש לעירור שזירה פועם (PIE), הקרן עוברת דרך מוליך גל במצב יחיד ומכווננת להספק לייזר של 10 עד 100 ננוואט עבור קווי לייזר של 481 ננומטר ו-637 ננומטר הנמדדים לאחר מראה דיכרואי.זה מבטיח קצב ספירת פוטון אופטימלי, תוך הימנעות מהשפעות של כינוי פוטון, הלבנת פוטו ורוויה.כיסויים או צלחות של μ-Slide angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, גרמניה) הונחו ישירות במי טבילה מעל עדשת Super Apochromat 60x NA 1.2 עם צווארון מתקן (Olympus Life Sciences, Waltham, ארה"ב).מראה דיכרואית 488/640 ננומטר (Semrock, Lake Forest, IL, ארה"ב) שימשה כמפצל האלומה הראשית.קרינה לא ממוקדת נחסמת על ידי חור בקוטר של 50 מיקרון, ואז הקרינה הממוקדת מחולקת ל-2 נתיבי זיהוי על ידי מפצל קרן 50/50.מול הגלאי נעשה שימוש במסנני פליטת פס פס (Semrock, Lake Forest, IL, ארה"ב) 520/35 עבור צבע ירוק (AF488) ו-690/70 עבור צבע אדום (Atto647N).דיודות מפולת חד פוטון (SPAD) (מכשירי מיקרו פוטון, בולצאנו, איטליה) שימשו כגלאים.גם איסוף הנתונים וגם הניתוח בוצעו באמצעות תוכנת SymphoTime64 הזמינה מסחרית (PicoQuant GmbH, ברלין, גרמניה).
חמישים מיקרוליטר של דגימות LLPS יושמו על בארות μ-Slide angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, גרמניה).התמונות המתקבלות ממוקדות ל-20 מיקרומטר מעל תחתית הבאר למרחק עבודה אובייקטיבי אופטימלי עבור טיפות תלויות ועד ~1 מיקרומטר עבור רפסודות ונקודות עם רזולוציה צירית של לפחות 0.25 מיקרומטר/פיקסל וזמן השהייה של 400 מיקרומטר/פיקסל.בחר נתונים על ידי החלת סף עוצמה המבוסס על עוצמת אות הרקע הממוצעת (PBG, ממוצע + 2σ) עבור כל ערוץ, כך שרק טיפות חלבון נוזלי, רפסודות או נקודות נבחרות, מסנן כל מקור אפשרי מהשלב המפוזר.כדי לנתח את תוחלת החיים של כל מין (τ) של כל ערוץ (ירוק, "g" עבור AF488 ואדום, "r" עבור Atto647N), בחרנו אזורי עניין (ROIs) המכילים טיפות, רפסודות או כתמים (איור משלים 1 ).8b) והפיקו אותם על ידי התאמת דעיכה לכל החיים שלהם (τD, τR ו-τP עבור טיפות, רפסודות או נקודות, בהתאמה, ראה איור משלים. 8c) בכל ערוץ באמצעות ניתוח התאמה לזנב ומודל דעיכה דו-רכיבי.ממוצע τ מ- τ .ROIs שהפיקו מעט מדי פוטונים להתאמה רב-מעריכית לא נכללו בניתוח.החתך שנעשה בו שימוש היה <104 פוטונים עבור רפסודות ונקודות ו-103 עבור נפילות.לטיפות יש סף נמוך יותר מכיוון שקשה להשיג עקומות דעיכה בעלות ערכי עוצמה גבוהים יותר, מאחר והטיפות בשדה התמונה לרוב קטנות יותר ופחות רבות.החזר ROI עם ספירת פוטון מעל מגבלת צבירת הפוטונים (מוגדרת ל->500 ספירות/פיקסל) נמחקו גם הם לניתוח.התאימו את עקומת דעיכת העוצמה המתקבלת מאזור העניין עם עוצמה של 90% מהמקסימום (קצת אחרי העוצמה המקסימלית של הדעיכה) מתחילת חיי השירות כדי להבטיח הפרעות IRF מינימליות תוך שמירה על זהה לכל דעיכת העוצמה הגדרות חלון זמן יחסי נותחו בין 25 ל-50 ROI עבור רפסודות וספוטים ו-15-25 ROI עבור נפילות, תמונות שנבחרו מתוך יותר מ-4 שכפולים שהוקלטו מ-3 ניסויים עצמאיים לפחות.בדיקות t דו-זנבות שימשו להערכת הבדלים סטטיסטיים בין מינים או בין מערכות coacervate.לצורך ניתוח פיקסל אחר פיקסל של משך החיים (τ), חושבה ההפחתה הכוללת של משך החיים על פני השדה עבור כל ערוץ ובוצעה קירוב של מודל הנחתה מעריכי של 2/3 רכיבים.הנחתת החיים של כל פיקסל הותאמה לאחר מכן באמצעות ערכי τ שחושבו קודם לכן, וכתוצאה מכך תמונת התאמה פסאודו-צבעונית של FLIM.טווח החיים של התאמה לזנב היה זהה בכל התמונות של אותו ערוץ, וכל דעיכה יצרה מספיק פוטונים כדי לספק התאמה אמינה.עבור ניתוח FRET, פיקסלים נבחרו על ידי החלת סף עוצמה נמוך יותר של 100 פוטונים, אשר ממוצע של אות רקע (FBG) של 11 פוטונים.עוצמת הקרינה של כל ערוץ תוקנה על ידי גורמי תיקון שנקבעו בניסוי: 69 הצלבה ספקטרלית α הייתה 0.004, עירור ישיר β היה 0.0305, יעילות הזיהוי γ הייתה 0.517.יעילות FRET ברמת הפיקסלים מחושבת לאחר מכן באמצעות המשוואה הבאה:
כאשר FDD היא עוצמת הקרינה הנצפית בערוץ התורם (ירוק), ה-FDA היא עוצמת הקרינה הנצפית בערוץ המקובל (אדום) תחת עירור עקיף, ו-FAA היא עוצמת הקרינה הנצפית בערוץ המקובל (אדום) תחת עירור ישיר ( פַּאִי).בערוץ נצפים פולסים של עוצמת הקרינה).
מניחים 100 μl של תמיסות תגובה LLPS המכילות 25 μM מונומרי ללא תווית Tau441 (עם או בלי 25 μM αS) במאגר LLPS (בתוספת כמפורט לעיל) על גבי מיקרופלטות 96-בארות לא מחייבות עם ציפוי נייר דבק והיווצרות טיפות נבדקה לאחר מיקרוסקופ WF שיווי משקל.תוך 10 דקותלאחר 48 שעות של דגירה בטמפרטורת החדר, אושרו נוכחות של רפסודות חלבון וכתמים.לאחר מכן הסר בזהירות את הנוזל מעל הרפסודות מהבארות, ולאחר מכן הוסף 50 ליטר של חיץ ניתוק (10 מ"מ HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 מ"מ DTT) ודגירה במשך 10 דקות.ריכוז המלח הגבוה מבטיח ש-LLPS לא יחזור על עצמו עקב שיורי PEG, ומכלולי חלבון אפשריים שנוצרו רק על ידי אינטראקציות אלקטרוסטטיות יפורקו.תחתית הבאר נגרדה בזהירות עם קצה מיקרופיפטה והתמיסה שהתקבלה הועברה לבאר תצפית ריקה.לאחר דגירה של הדגימות עם 50 מיקרומטר ThT למשך שעה, נבדקה נוכחותם של כתמים מבודדים במיקרוסקופ WF.הכן סיני αS sonicated על ידי דגירה של 300 μl של תמיסת αS 70-μM ב-PBS עם pH 7.4, נתרן אזיד 0.01% ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד על שייקר אורביטלי למשך 7 ימים.לאחר מכן, התמיסה עברה צנטריפוגה ב-9600×g למשך 30 דקות, הכדור הוחלף מחדש ב-PBS pH 7.4 ועבר דגימות פיבריל (דקה אחת, מחזור 50%, משרעת 80% ב-Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, ניוטון, ארה"ב). עם חלוקת גודל אחידה יחסית של סיבים קטנים.
ניתוח FCS/FCCS וזיהוי צירוף מקרים של שני צבעים (TCCD) בוצעו על אותו מיקרוסקופ פלורסנט קונפוקאלי עם פתרון זמן MT200 (Pico-Quant, ברלין, גרמניה) המשמש לניסויי מיקרוסקופיה FLIM-FRET באמצעות מצב PIE.עוצמת הלייזר עבור ניסויים אלה נוספה ל-6.0 מיקרו-ואט (481 ננומטר) ו-6.2 מיקרו-ואט (637 ננומטר).השילוב של כוחות הלייזר הללו נבחר כדי לייצר בהירות דומה עבור זוגות הפלואורופורים המשמשים תוך השגת קצבי ספירה אופטימליים והימנעות מהלבנה ורוויה.גם איסוף הנתונים וגם הניתוח בוצעו באמצעות תוכנת SymphoTime64 זמינה מסחרית גרסה 2.3 (PicoQuant, ברלין, גרמניה).
דגימות של אגרגטים מבודדים αS/Tau המתקבלים באמצעות LLPS מדוללים במאגר בידוד לריכוז המונומולקולרי המתאים (בדרך כלל דילול של 1:500, מכיוון שהאגרגטים כבר נמצאים בריכוזים נמוכים כאשר הם מבודדים מדגימות קואצרבאט).דגימות יושמו ישירות על כיסויי כיסוי (Corning, ארה"ב) מצופים מראש בתמיסת BSA בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
עבור ניתוח PIE-smFRET בערוץ הירוק והאדום, הוחל סף עוצמה נמוך יותר של 25 פוטונים כדי לסנן אותות בעוצמה נמוכה הנגרמים על ידי אירועים מונומריים (שים לב שמספר המונומרים עולה על הדגימות המצטברות בהשוואה לאגרגטים מבודדים).סף זה חושב פי חמישה מהעוצמה הממוצעת של αS מונומרי שהתקבלה מניתוח דגימות מונומר טהור על מנת לבחור באופן ספציפי אגרגטים לניתוח.מעגל הכונן PIE, יחד עם רכישת נתונים של TSCPC, אפשרו את היישום של מסנן שקלול לכל החיים המסייע בביטול רקע והצלבה ספקטרלית.עוצמת ההתלקחות שנבחרה באמצעות הספים לעיל תוקנה באמצעות אות הרקע הממוצע שנקבע מההיסטוגרמות של התרחשות לעומת עוצמת/פח של דגימות המאגר בלבד.התפרצויות הקשורות לצברים גדולים תופסים בדרך כלל מספר פחים עוקבים במעקב הזמן (מוגדר ל-1 ms).במקרים אלו נבחר פח בעל חוזק מרבי.עבור FRET וניתוח סטוכיומטרי, נעשה שימוש בגורם הגמא γ שנקבע תיאורטית (0.517).תרומות הצלבות ספקטרליות ועירור ישיר הן זניחות (נקבעות בניסוי) בכוח לייזר עירור בשימוש.היעילות והסטוכיומטריה של FRET בפיצוץ מחושבים כדלקמן.