ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 צינור מרותך דופלקס לתעשייה הכימית רכיב כימי, מחסור ב-SPECC1L מוביל ליציבות מוגברת של מפרקים שחבורים ולנשירה מופחתת של תאי ציצה עצביים גולגולתיים.

תודה שביקרת ב-Nature.com.אתה משתמש בגרסת דפדפן עם תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בנוסף, כדי להבטיח תמיכה שוטפת, אנו מציגים את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 צינור מרותך דופלקס לתעשייה הכימית

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.היא יצרנית מובילה המתמחה בצינורות נירוסטה ללא תפרים, צינורות מחושלים בהירים, צינורות מפותלים ללא תפרים וכו '.על מנת להקל על הלקוחות, יש לנו גם צינורות וצינורות מרותכים.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.בעלת ציוד ייצור ובדיקה המתקדם ביותר.אנחנו לגמרי יכולים לספק את הדרישה שלך.על פי התקן בקפדנות רבה, לשפופרות המיוצרות על ידינו תמיד יש סובלנות OD ו-WT נכונה.בקרת הסובלנות היא בהחלט בהתאם לתקני הייצור.המוצרים שלנו תמיד מרוצים מהלקוחות.לקוחות שרכשו את המוצרים שלנו יצרו יותר רווחים.
א) OD (קוטר חיצוני): 3.18 מ"מ עד 101.6 מ"מ
ב) WT (עובי קיר): 0.5 מ"מ עד 20 מ"מ
ג) אורך: על פי דרישת הלקוח
ד) תקנים: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 וכו'
ה) שיטת תהליך: ERW, EFW וכו'

סליידרים המציגים שלושה מאמרים בכל שקופית.השתמש בלחצנים 'הקודם' וה'הבא' כדי לעבור בין השקופיות, או בלחצני בקר השקופיות שבקצה כדי לעבור בין כל שקופית.
תאי הקרם העצביים של הגולגולת (CNCC) יורדים מהקפלים העצביים העובריים ונודדים אל קשתות הלוע, היוצרות את רוב מבני הפנים.תפקוד לקוי של CNCC ממלא תפקיד חשוב באטיולוגיה של שסע אורופיאלי, מום מולד שכיח.מוטציות הטרוזיגוטיות SPECC1L נמצאו בחולים עם שסעים לא טיפוסיים ותסמונתיים.כאן אנו מדווחים על צביעה משופרת של רכיבי צומת דבק קנוניים (AJ), β-catenin ו-E-cadherin בתאי נוק-דאון מתורבתים של SPECC1L, ומיקרוגרפי אלקטרונים מראים דיפוזיה אפיקלית-בסיסית של AJ.כדי להבין את התפקיד של SPECC1L במורפוגנזה קרניופציאלית, יצרנו מודל עכבר חסר Specc1l.מוטנטים הומוזיגוטים הם קטלניים עובריים ומציגים סגירת צינור עצבי לקוי ולמינציה של CNCC.צביעת חלבון AJ מוגברת בקפלים עצביים מוטנטיים.פגם AJ זה עולה בקנה אחד עם פגם בדלמינציה של CNCC, המחייב פירוק AJ.בנוסף, מוטנטים Specc11 הפחיתו את איתות PI3K-AKT והגדילו את האפופטוזיס.במבחנה, עיכוב קל של איתות PI3K-AKT בתאים מסוג פרא היה מספיק כדי לגרום לשינויי AJ.חשוב לציין, ניתן לבטל שינויים ב-AJ שנגרמו על ידי ביטול SPECC1L על ידי הפעלה של מסלול PI3K-AKT.יחד, נתונים אלה מצביעים על כך ש-SPECC1L, כמווסת חדש של איתות PI3K-AKT וביולוגיה של AJ, נדרש עבור סגירת צינור עצבי וריבוד CNCC.
תאי עצב עצביים (CNCCs) מתמקמים לנוירואקטודרם הגבי ומתנתקים מהנוירו-אפיתל של הקפלים העצביים המתפתחים באמצעות תהליך הכולל את המעבר האפיתל-מזנכימלי (EMT) 1,2,3.CNCC אפיתל קדם-מהגר משבש את הצמתים הבין-תאיים והופכים ל-CNCC mesenchymal נודד הממלאים את קשת הלוע הראשונה והשנייה ויוצרים את רוב הסחוס הקרניופציאלי.לפיכך, גנים המווסתים את תפקוד ה-CNCC מופרעים לעתים קרובות באטיולוגיה של חריגות מולדות גולגולתיות, כגון שסעים אורופציאליים, המשפיעים לרוב על 1/800 לידות בארה"ב בלבד.אחד העיוותים המולדים8.
דלמינציה של ה-CNCC עולה בקנה אחד עם סגירת הצינור העצבי הקדמי בין 8.5 ל-9.5 ימים של התפתחות עוברית בעכברים.מוטנטים של מספר גנים הקשורים לשסע או-פנים של עכברים מציגים גם צורה כלשהי של פגם בצינור העצבי, כולל Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 ו-Pdgfrα12.עם זאת, התהליכים של סגירת צינור עצבי וריבוד CNCC יכולים להיחשב עצמאיים, שכן העכבר המוטנטי של Splotch (Pax3) מציג פגמים בסגירת הצינור העצבי ללא כל השפעה על ריבוד או הגירה של CNCC 13,14.מודלים נוספים של עכברים עם פגמים בנתיחה של CNCC וסגירת צינור עצבי יסייעו לשרטט את הבסיס המולקולרי המשותף של שני תהליכים אלה.
בידוד של CNCC מתאי נוירו-אפיתל מצריך פירוק של צמתים דבקים (AJs), המורכבים מתסביכי חלבון המכילים, בין היתר, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin ו-α-actinin הקשורים לחוטי אקטין 2. מחקרי ביטוי יתר E-cadherin בקפלים עצביים הראו הפחתה או עיכוב בדלמינציה של CNCC.לעומת זאת, דיכוי של E-cadherin גורם לריבוד מוקדם15,16.רבים מהגורמים המתווכים EMT במהלך ריבוד CNCC הם גורמי שעתוק (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) ומטריצה ​​חוץ-תאית (ECM) שיפוץ חלבונים כגון מטריצת מטלופרוטאינזים (MMPs), אולם CNCCs הם מווסתים ישירים של AJ ציטושלד. עדיין לא ידוע.ידוע שמסלול PI3K-AKT נוגד רמות E-cadherin, בעיקר מחקרי סרטן17.מחקרים אחרונים הראו כי אובדן איתות PI3K-AKT מבוסס PDGFα בעכברים מוביל להפרעות קרניופציאליות, כולל חיך שסוע ומומים בצינור העצבי12.עם זאת, הקשר בין מסלול PI3K-AKT ליציבות AJ לאחר ריבוד CNCC אינו ברור.
זיהינו בעבר את SPECC1L כגן המוטנטי הראשון בשני אנשים עם שסע חמור המשתרע מהפה לעין, המכונה שסע אלכסוני (ObFC) או Tessier IV18 cleft.מוטציות SPECC1L זוהו בשתי משפחות רב-דוריות עם תסמונת אוטוזומלית דומיננטית Opitz G/BBB (OMIM #145410), שבהן אנשים שנפגעו הפגינו מרחק יתר ושפה/חך שסועה19, ובמשפחה אחת עם תסמונת מרחק יתר של טיבי (OMIM #145420)20 .יותר ממחצית מהמקרים של תסמונת Opitz G/BBB קשורים ל-X (OMIM #300000) ונגרמים על ידי מוטציות בגן MID1, המקודד לחלבון 22 של שלד התא הקשור למיקרוטובולה.אנו משערים כי SPECC1L, גם חלבון הקשור למיקרו-צינוריות ולשלד האקטין, עשוי לתווך איתותים הנדרשים לעיצוב מחדש של ציטו-שלד האקטין במהלך הידבקות והגירה של תאים 18.באמצעות מחקרים in vitro ו-in vivo, אנו מתארים כעת את SPECC1L כמווסת חדש של יציבות AJ באמצעות איתות PI3K-AKT.ברמה התאית, מחסור ב-SPECC1L גרם לירידה ברמת החלבון pan-AKT ולעלייה בפיזור האפיקלי-בזאלי של AJ, אשר סולק על ידי הפעלה כימית של מסלול ה-AKT.In vivo, עוברים חסרי Specc11 מראים סגירת צינור עצבי לקוי וניתוח מופחת של CNCC.לפיכך, SPECC1L מתפקד באיתות מבוסס הידבקות תאים מווסת מאוד הנדרשת לתפקוד תקין של CNCC במהלך מורפוגנזה של הפנים.
כדי לאפיין את התפקיד של SPECC1L ברמה התאית, השתמשנו בקו תאי אוסטאוסרקומה יציב שתואר קודם לכן U2OS חסר ב-SPECC1L18.לתאי U2OS יציבים אלו עם נפילת SPECC1L (kd) הייתה ירידה מתונה (60-70%) ברמות התמלילים והחלבונים של SPECC1L, יחד עם פגמים בנדידה וארגון מחדש של ציטושלד האקטין 18. לעומת זאת, ירידה חולפת חמורה ב הוכח כי SPECC1L מוביל לפגמים מיטוטיים 23 .לאחר אפיון נוסף, מצאנו שתאי SPECC1L-kd היציבים שלנו שינו מורפולוגיה בדרגה גבוהה מאוד של מפגש (איור 1).תאי בקרה בודדים ותאי kd במפגש נמוך נראו דומים (איור 1A,D).24 שעות לאחר היתוך, תאי הבקרה שמרו על צורתם הקובית (איור 1B, E), בעוד שתאי SPECC1L-kd התארכו (איור 1C, F).מידת השינוי הזה בצורת התא נתפסה על ידי הדמיה חיה in vivo של תאי בקרה ותאי kd (סרט 1).כדי לקבוע את התפקיד של SPECC1L בתאים מתכנסים, בדקנו תחילה את הביטוי שלו.מצאנו שרמות החלבון SPECC1L עלו עם היתוך (איור 1G), בעוד שרמות התמלול של SPECC1L לא עלו (איור 1H).בנוסף, ככל שצפיפות התאים עלתה, חלבון SPECC1L הצטבר בגבולות בין-תאיים (איור 2A-E), עם דפוס חופף לזה של β-catenin הקשור לממברנה (איור 2A'-E').בהתחשב בקשר של SPECC1L עם ציטושלד האקטין 18,23, שיערנו ש-SPECC1L יוצר אינטראקציה עם חיבורים דבקים מבוססי אקטין (AJ).
תאי (AF) SPECC1L knockdown (DF) מתארכים במפגש גבוה (F) בהשוואה לתאי U2OS בקרה (AC).מוצגות כאן שלוש מתוך שש נקודות הזמן (T1, T3, T6) שבחרנו עבור צפיפויות תאים שונות.(ז) ניתוח כתם Western המראה שחלבון SPECC1L מתייצב בדרגה גבוהה של מפגש בהשוואה לדרגה נמוכה של מפגש בתאי בקרה.כתם מערבי של SPECC1L מראה את הרצועה הצפויה של 120 kDa ופס במשקל מולקולרי גבוה יותר, אולי לאחר שינוי תרגום (*).ניתוח כתם Western בוצע באותם תנאים עבור מפגש נמוך וגבוה.תמונות המציגות SPECC1L במפגש נמוך וגבוה נלקחו מאותו כתם.אותו כתם הוסר ונבדק מחדש עם נוגדן β-אקטין.(ח) ניתוח RT-PCR כמותי לא הראה שינויים משמעותיים ברמות תמליל SPECC1L.פסי שגיאה מייצגים SEM מארבעה ניסויים עצמאיים.
(AE) בחרנו שש נקודות זמן (T1-T6) המייצגות טווח של צפיפות תאים כדי לנרמל את ניתוח צורת התא ושינויי AJ בתאי U2OS עם SPECC1L knockdown (kd).חמש נקודות הזמן הראשונות הללו כללו תאים בודדים (T1), 50-70% היתוך של צבירי תאים קטנים (T2), היתוך ללא עיצוב מחדש של תאי kd (T3), עיצוב מחדש של תאי kd (T4) ושינויים של 24 שעות.בצורה האחורית של תאי kd (T5).החלבון SPECC1L היה מפוזר בעיקר בציטופלזמה ב-T1 (A), אך הצטברותו נצפתה בגבולות בין-תאיים בנקודות זמן עוקבות (B-E, חיצים).(FJ) β-catenin מראה הצטברות דומה בגבולות בין תאיים הקשורים לקומפלקס AJ.(A'-E') SPECC1L ו-β-catenin מראים צביעה חופפת בגבולות התא בצפיפות תאים גבוהה (חצים).(F'-J') בתאי SPECC1L-kd, צביעת β-catenin נראית תקינה בצפיפות תאים נמוכה (F'-H'), אך מתרחבת ככל שצורת התא משתנה (I', J'; חצים), מה שמצביע על כך AJ השתנו.פסים = 10 מיקרומטר.
לאחר מכן ניסינו לקבוע את ההשפעה של חוסר SPECC1L על AJ.השתמשנו במספר סמנים הקשורים ל-AJ, כולל הרכיבים הקנוניים F-actin, myosin IIb, β-catenin ו-E-cadherin24,25,26,27.סיבי סטרס אקטין גדלו בתאי SPECC1L-kd כפי שתואר קודם לכן (איור 3A,B) 18.Myosin IIb הקשור לחוטי אקטין הראה עלייה דומה בתאי SPECC1L-kd במבחנה (איור 3C,D).β-catenin הקשור ל-AJ נקשר לקדהרין בממברנת התא, מראה דפוס ביטוי נורמלי של "חלת דבש" בקובוציטים בשליטה (איור 3E,G).מעניין לציין כי בתמונות שטוחות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, צביעה של β-catenin (איור 3E,F) ו-E-cadherin (איור 3G,H) על קרום התא של תאים מתכנסים חסרי SPECC1L הראו דפוסים בולטים של צביעה מורחבת.התרחבות זו של צביעת β-catenin הקשורה ל-AJ בתאי kd הייתה בולטת ביותר במפגש, אך נראה כי קדמה לשינויים בצורת התא (איור 2F-J, F'-J').כדי לקבוע את האופי הפיזי של צביעה AJ מורחב זה, בחנו את גבולות התא על פני השטח האפיקי-בזאלי של תאי SPECC1L-kd U2OS על ידי מיקרוסקופיה אלקטרונית העברה (TEM) (איור 3I,J).בניגוד לתאי בקרה (איור 3I), שהיו להם אזורים צפופים אלקטרונים נפרדים המעידים על AJ (חצים), תאי kd (איור 3J) הראו אזורים גדולים ורציפים של צפיפות אלקטרונים גבוהה המעידים על AJ לאורך המישור האפיקובסלי..בנוסף, בחתכים רוחביים, צפינו בקפלים נרחבים של קרום התא בתאי kd (איור S1A,B), מה שמסביר את התבנית המורחבת של להקות צביעת β-catenin ו-E-cadherin (איור 3F,H).כתמיכה בתפקיד של SPECC1L ב-AJs, β-catenin הוחלף יחד עם SPECC1L בליזטים של תאי U2OS מתלכדים (איור 3K).יחד עם צביעה חיסונית מורחבת עבור סמני AJ, ניתוח TEM עלה בקנה אחד עם ההשערה שלנו כי מחסור ב-SPECC1L מגביר את הצפיפות והשונות של AJ apical-basal.
(AH) צביעה מוגברת של F-actin בתאי kd ב-48 שעות לאחר היתוך (T6; A, B).צביעה שונה של מיוזין IIb הקשורה ל-F-אקטין (C, D).הדפוס החלק של צביעת קרום β-catenin ו-E-cadherin בתאי בקרה (E, G) הוגבר בתאי SPECC1L-kd (F, H).פסים = 10 מיקרומטר.(I-J) מיקרוגרפי אלקטרונים המתבוננים בצומת הבין-תאי האפיקי-בזאלי.תאי בקרה מראים אזורים צפופים אלקטרונים ברורים המציינים צמתים דביקים (I, חיצים).לעומת זאת, כל הצומת האפיקי-בזאלי בתאי SPECC1L-kd נראה צפוף באלקטרון (J, חיצים), מה שמעיד על צפיפות מוגברת ופיזור של צמתים דבקים.(K) β-catenin הושג יחד עם SPECC1L בליזטים של תאי U2OS משולבים.תמונה שצולמה מנקודה אחת המייצגת אחד מארבעה ניסויים עצמאיים.
כדי להבין את התפקיד של SPECC1L במורפוגנזה של גולגולת פנים, יצרנו מודל עכבר חסר Specc1l באמצעות שני קווי תאים עצמאיים מסוג ES, DTM096 ו-RRH048 (BayGenomics, CA), המייצגים תעתיקי אינטררון 1 ו-Spec1l נלכדו ב-15 (איור 1). .4A, איור S2).המיקום הגנומי של הוספה של וקטור ההטעיה נקבע על ידי רצף גנום שלם ואושר על ידי PCR (איור S2).שני עיצובי מלכודת הגנים אפשרו גם היתוך בתוך המסגרת של כתבי Specc11-lacZ עם לכידה.לכן, ביטוי lacZ שנקבע על ידי צביעת X-gal שימש כאינדיקטור לביטוי Specc11.שני האללים הראו דפוסי ביטוי דומים של lacZ, כאשר מלכודת הגנים DTM096 באינטרון 1 הראתה ביטוי חזק יותר מ-RRH048 באינטררון 15 (לא מוצג).עם זאת, Specc1l מתבטא באופן נרחב, עם ביטוי חזק במיוחד בקפלים העצביים ב-E8.5 (איור 4B), בצינור העצבי ובתהליכי הפנים ב-E9.5 ו-E10.5 (איור 4C,D), ובגפיים מתפתחות. ב-E10.5 ועיניים (איור 4D).דיווחנו בעבר כי ביטוי SPECC1L בקשת הלוע הראשונה ב-E10.5 היה קיים באפיתל ובמזנכימה18 הבסיסית, בהתאם לשושלת CNCC.כדי לבדוק את ביטוי SPECC1L ב-CNCC, ביצענו קפלים עצביים E8.5 (איור 4E-J) וחתכי גולגולת E9.5 (איור 4K-).ב-E8.5, SPECC1L מוכתם קפלים עצביים בצורה אינטנסיבית (איור 4E, H), כולל תאים שנצבעו בסמני NCC (איור 4G, J).ב-E9.5, SPECC1L (איור 4K, N) צובע בחוזקה CNCC נודד שנצבע בשיתוף עם AP2A (איור 4L, M) או SOX10 (איור 4O, P).
(א) ייצוג סכמטי של הגן Specc11 של העכבר המראה החדרת וקטור פיתוי בשיבוטי תאים ES DTM096 (אינטררון 1) ו-RRH048 (אינטרון 15).(BD) צביעת lacZ של עוברי Specc1lDTM096 הטרוזיגוטיים המייצגים ביטוי Specc1l מ-E8.5 עד E10.5.NE = neuroectoderm, NF = קפל עצבי, PA1 = קשת הלוע הראשונה.(EP) צביעה חיסונית של SPECC1L עם סמני NCC AP2A ו-SOX10 בקפלים עצביים E8.5 (NF; EJ) וחתכי גולגולת E9.5 (KP).צביעת SPECC1L נצפתה באופן נרחב בקפלים עצביים E8.5 (E, H; ראשי חץ), כולל תאים המסומנים עם AP2A (F, G; ראשי חץ) ו- SOX10 (I, J; ראשי חץ).ב-E9.5, SPECC1L צובע בחוזקה CNCCs נודדים (K, N; חצים) המסומנים AP2A (L, M; חיצים) ו-SOX10 (O, P; חיצים).
הצלבה בין עכברים הטרוזיגוטיים Specc1lDTM096/+ ו- Specc1lRRH048/+ מראה ששני האללים של מלכודת הגנים אינם משלימים וכי הטרוזיגוטים מורכבים והומוזיגוטים עובריים עבור כל אלל מלכודת גנים הם קטלניים עובריים (טבלה S1).יחסי מנדל הצביעו על ירידה בשיעור ההישרדות של הטרוזיגוטים בלידה (צפי ל-1.34 לעומת 2.0).ציינו תמותה סב-לידתית נמוכה בקרב הטרוזיגוטים, לחלקם היו אנומליות קרניופציאליות (איור S3).עם זאת, החדירה הנמוכה של פנוטיפים קרניופציאליים סביב הלידה הללו מקשה על לימוד המנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים שלהם.לכן, התמקדנו בפנוטיפ הקטלני העוברי של מוטציות Specc11 הומוזיגוטיות.
רוב העוברים הטרוזיגוטיים או ההומוזיגוטים Specc1lDTM096/RRH048 המוטנטיים לא התפתחו לאחר E9.5-10.5 (איורים 5A-D), והצינור העצבי לא נסגר קדמי (איורים 5B, D) ולפעמים נסגר מאחור (לא מוצג) ..פגם זה בסגירת הצינור העצבי הגולגולתי היה קשור לרוב ה-CNCC המסומן DLX2 שנותר בקפלים העצביים ב-E10.5, מה שמצביע על אי דיסקציה (איור 5A'-D').כדי לקבוע אם גם הגודל הכולל של CNCC הצטמצם, תייגנו קווי CNCC עם GFP בקווי מלכודת הגנים שלנו עם Wnt1-Cre ו-ROSAmTmG.הזרמנו GFP+ NCC ו- GFP- (RFP+) שאינם NCC ממוינים מעוברים שלמים.ב-E9.5, השיעור של CNCC ממוינים בזרימה לא השתנה באופן משמעותי בין WT ועוברי מוטציה (לא מוצג), מה שמצביע על מפרט CNCC תקין.לכן, שיערנו ששארית צביעה של Wnt1-Cre ו-DLX2 בקפלים עצביים חשופים (איור 5B') נבעה משכבת ​​CNCC פגומה, אולי עקב צפיפות מוגברת או פיזור של תאי AJ, כפי שניתן לראות בתאי SPECC1L-kd.השתמשנו בסמני NCC SOX10, AP2A ו-DLX2 כדי לאשר את נוכחותו של CNCC בקפל העצבי (איור 5E-R).ב-E8.5, צביעה של קפל עצבי עבור כל שלושת סמני ה-NCC נצפתה בחלקים של WT (איור 5E, G, I) ומוטנטי Specc1l (איור 5F, H, J).ב-E9.5, בעוד סמני NCC הצביעו NCC נודדים בקטעי WT (איור 5M, O, Q), נצפתה צביעת NCC שיורית בקפלים עצביים חשופים של עוברים מוטנטיים Specc1l (איור 5N, P, R).מכיוון ש-SOX10 ו-DLX2 מסמנים CNCC נודדים, תוצאה זו מעידה על כך ש-CNCCs חסרי SPECC1L משיגים מפרט שלאחר הנדידה אך אינם מצליחים לנדוד מקפלים עצביים.
מחסור ב-Spec11 מוביל לסגירת צינור עצבי לקוי, דה למינציה של תאי קרסט עצבי גולגולתי ו-AJs.
(א, ב') E9.5 WT (א) עובר נושא נודדת תאים עצביים גולגולתיים (CNCC) המסומנים עם Wnt1-Cre (A').לעומת זאת, עוברים מוטנטיים Specc11 מראים קפלים עצביים פתוחים (B), ראשי חץ) ו-CNCCs שלא היגרו (B', ראשי חץ).(C, D') תמונות שדה בהירות (C, D') וצביעה חיסונית (C', D') של סמן CNCC DLX2 של עוברי E10.5 WT (C, C') ו- Specc1l (D, D').בעוברים של WT E10.5, CNCC חיובי ל-DLX2 מיישב את קשתות הזימים (C', חיצים), בעוד שבמוטנטים, צביעה בולטת נמשכת בקפלים העצביים הפתוחים (D', חיצים) ובקשתות הלוע הראשונות (D', חיצים).) עם כמה מכתים (חצים) המצביעים על דלמינציה גרועה והגירה של CNCC.ER) קטעים של עוברים מוטנטיים של WT ו- Specc1l בשלבים E8.5 (E-L) ו-E9.5 (M-R) סומנו בסמני NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) ו-DLX2 (I, J, Q, R).ב-E8.5, נצפתה צביעת NCC בקפל עצבי מסוג פראי (NF) ובחתכים מוטנטיים.צביעה משותפת של SOX10 ו-β-catenin ב-E8.5 WT (K) ומוטאנט (L) גילתה צביעה מוגברת של β-catenin בגבולות התאים בקפלים העצביים.ב-E9.5, נצפתה צביעה פראית של CNCC נודדים (M, O, Q), בעוד שבמוטנטים, CNCCs לא מרובעים הצביעו קפלים עצביים פתוחים (N, P, R).(S-Z) ניתוח תיוג AJ in vivo בחתכים קורונליים של עוברי WT ו- Specc11DTM096/RRH048 עם המוטציה E9.5.מישור חתך משוער מוצג בפינה הימנית העליונה.בקטעים של רקמות מוטנטיות, נצפתה צביעה מוגברת של F-actin (S, T) ומיוזין IIb (U, V).בדומה לתוצאות במבחנה באיור 3, בעוברים מוטנטים, נצפתה צביעת ממברנה משופרת עבור β-catenin (W, X) ו-E-cadherin (Y, Z).(AA-BB) מיקרוסקופ אלקטרוני של קטע של עובר מסוג פרא המביט מעבר לגבול התא האפיקי-בזאלי מראה אזור מובהק צפוף אלקטרונים המעיד על צמתים דבקים (AA, חיצים).לעומת זאת, בקטעים של עוברים מוטנטיים Specc11 (BB, חיצים), כל צומת האפיקובזל צפוף באלקטרון, מה שמעיד על צפיפות מוגברת ופיזור של צמתים דבקים.
כדי לבדוק את ההשערה שלנו שהשכבות המופחתות נובעות מ-AJ שונה, בחנו תיוג AJ בקפלים עצביים חשופים של עוברים מוטנטיים Specc1l (איור 5S-Z).ראינו עלייה בסיבי סטרס אקטין (איור 5S, T) ובמקביל לוקליזציה מוגברת של צביעת מיוזין IIB על סיבי אקטין (איור 5U, V).חשוב לציין, ראינו צביעה מוגברת של β-catenin (איור 5W,X) ו-E-cadherin (איור 5Y,Z) בגבולות בין-תאיים.כמו כן, בחנו צביעת β-catenin של NCC בקפלים העצביים של עוברי E8.5 (איור 5K, L).נראה שצביעת β-catenin הייתה חזקה יותר בקפלים עצביים מוטנטיים Specc1l (איור 5L ו-K), מה שמרמז על כך שהחלו שינויים ב-AJ.במיקרוגרפי אלקטרונים של קטעי גולגולת של עוברי E9.5, ראינו שוב צביעה מוגברת צפופה באלקטרון בעוברים מוטנטיים Specc1l בהשוואה ל-WT (איור 5AA, BB ו-S1E-H).ביחד, תוצאות אלו תומכות בתוצאות החוץ-גופניות שלנו בתאי SPECC1L-kd U2OS ומצביעות על כך שצביעת AJ חריגה קודמת לריבוד CNCC בעוברים המוטנטים שלנו.
בהתחשב בקשר האנטגוניסטי הידוע בין פעילות AKT ויציבות E-cadherin, 17,28 שיערנו את המעורבות של איתות PI3K-AKT.בנוסף, ראינו שלפוחיות תת-אפידרמיסיות בחלק מהעוברים המוטנטים שלנו שחמקו מקטלניות (<5%) ב-E9.5-10.5 ובמקום זאת התיישבו בסביבות E13.5 (איור S3).שלפוחיות תת אפידרמיסיות הן סימן היכר של איתות מופחת PI3K-AKT המבוסס על PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) דיווחו שהפרעה בהפעלת PI3K מבוססת PDGFRα בעוברים מוטנטיים PdgfraPI3K/PI3K גורמת לשלפוחיות תת-אפידרמיליות, למומים בצינור העצבי ולפנוטיפים של חיך שסוע.ואכן, רמות של pan-AKT ו-Ser473-AKT מזרחן פעיל הופחתו in vivo ברקמות מוטנטיות Specc1l למעצר עוברי E9.5 (איור 6A-D).הירידה ברמות של Ser473-AKT מזורחן עשויה לנבוע לחלוטין מהירידה ברמות של pan-AKT in vivo (איור 6E) ובמבחנה (איור 6F).ירידה חוץ גופית נצפתה רק כאשר תאי U2OS היו מתחברים מאוד עם שינויים בצורת התא ובצפיפות AJ (איור 6D).לפיכך, הנתונים שלנו מצביעים על כך ש-SPECC1L הוא מווסת חיובי חדש של איתות PI3K-AKT במורפוגנזה קרניופציאלית.
(A–E) מקטעי גולגולת E8.5 (A,B) ו-E9.5 (C,D) או lysates E9.5 מעוברים מוטנטיים Specc1l (E) המציגים רמות של S473-AKT מזורחן פעיל והפחתת חלבון pan-AKT , בהשוואה לבקרה WT.סופג מערבי בוצע על lysates מסוג פראי ועל lysates מוטנטים באותם תנאים.התמונות המוצגות עבור SPECC1L נלקחו מכתם אחד.אותו כתם הוסר ונבדק מחדש עם נוגדנים אנטי-פאן-ACT ו-β-אקטין.רמות Pan-AKT בקפלים עצביים E8.5 (A, B) ורמות של S473-AKT מזורחן בחתכי גולגולת E9.5 הופחתו משמעותית.(ו) רמות Pan-AKT הופחתו באופן דומה בליזטים של תאי SPECC1L-kd U2OS שנקטפו במפגש גבוה.פסי שגיאה מייצגים SEM משלושה כימות עצמאיות של כתם מערבי.(GJ) קטעים של עוברי WT ב-E9.5 שנצבעו ב-KI67 ובקספאז 3 מפוצל, בהתאמה, המציגים שגשוג תאים (G, G') ופעילות אפופטוטית מועטה (H, H').עוברים מוטנטיים של Specc11 מראים שגשוג תאים דומה (I), אך מספר התאים העוברים אפופטוזיס גדל באופן משמעותי (J).
לאחר מכן בדקנו סמנים של ריבוי ואפופטוזיס.לא ראינו שום הבדל בשגשוג של עוברי E9.5 (איור 6E, G בהשוואה ל-I) עם מדד שגשוג של 82.5% עבור מוטציות WT ו-86.5% עבור מוטציות Specc1l שנמדדו על ידי צביעת KI67 (p<0.56, פישר's בדיקה מדויקת).באופן דומה, לא ראינו שום הבדל באפופטוזיס שנמדד על ידי צביעה עבור קספאז 3 שסוע בקפלים עצביים ב-E8.5 עד לעצירת עובר (לא מוצג) (לא מוצג).לעומת זאת, אפופטוזיס גדל באופן משמעותי בכל העוברים המוטנטים E9.5 (איור 6F, H ו-J).עלייה כוללת זו באפופטוזיס עולה בקנה אחד עם הפחתת איתות PI3K-AKT וקטלניות עוברית מוקדמת29,30,31.
לאחר מכן, כדי לאשר תפקיד סיבתי לאיתות PI3K-AKT בשינויי AJ בתאי ה-kd שלנו, שינינו כימית את המסלול בתאי הבקרה וה-kd (איור 7A-F).השתמשנו כסמן בפנוטיפ שינוי צורת התא שנצפה בתאי SPECC1L-kd מתלכדים, אותם כימתנו באמצעות היחס בין הממד הארוך ביותר (אורך) לממד האנכי המקביל (רוחב).יחס של 1 צפוי עבור תאים עגולים או קוביים יחסית (איור 7G).בנוסף לצורת התא, אישרנו גם את ההשפעה על AJ על ידי צביעת β-catenin (איור 7A'-F').עיכוב של מסלול PI3K-AKT באמצעות wortmannin היה מספיק כדי לשנות את צורת התא בתאי בקרה (איור 7A,C) ו-AJ (איור 7A').מפעיל PI3K-AKT SC-79 לא השפיע על צורת התא (איור 7A, E) או התרחבות AJ (איור 7A') בתאי בקרה.בתאי SPECC1L-kd, דיכוי נוסף של מסלול PI3K-AKT גרם לאפופטוזיס מוגברת (איור 7B,D) ולעלייה ניכרת בצביעה β-catenin (איור 7B'), בהתאם למוטנטים הכבדים שלנו in vivo.חשוב לציין, הפעלה של מסלול PI3K-AKT שיפרה משמעותית את צורת התא (איור 7B,F) ואת הפנוטיפים של AJ (איור 7B").שינויים בצורת התא כומתו כיחס עגולות תאים (CCR) והשוו עבור מובהקות כמתואר לעיל (איור 7G).ואכן, בתאי ביקורת (איור 7G, CCR = 1.56), טיפול בוורטמנין היה מספיק כדי לשנות באופן משמעותי את צורת התא (איור 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9) במידה דומה לזו שנצפה ב-SPECC1L.תאי -kd (איור 7G, CCR = 3.46).טיפול Wortmannin בתאי SPECC1L-kd (איור 7G, CCR = 3.60, זניח) לא היה משמעותי יותר מתאי kd לא מטופלים (איור 7G, CCR = 3.46, זניח) או תאי ביקורת שטופלו ב-wortmannin (איור 7G)., CCR = 3.46, זניח) משפיע בנוסף על התארכות התא (7G, CCR = 3.61, זניח).והכי חשוב, מפעיל SC-79 AKT שיחזר את הפנוטיפ המוארך של תאי SPECC1L-kd (איור 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).תוצאות אלו מאשרות ש-SPECC1L מווסת את איתות PI3K-AKT ומצביעות על כך שירידה מתונה ב-SPECC1L משפיעה על הידבקות התא, בעוד שירידה חזקה מובילה לאפופטוזיס (איור 8).
(A–F') תאי בקרה (A, C, E) ו- SPECC1L-kd (B, D, F) שטופלו בטיפול מעכב מסלול PI3K-AKT wortmannin (C, D) או SC-79 activator (E, F) תאי בקרה לא מטופלים הם קוביים (A) עם צביעה תאית רגילה של β-cat (A'), בעוד שתאי kd מוארכים (B) עם צביעה מוגברת של β-cat (B').לאחר דיכוי מסלול PI3K-AKT, תאי בקרה התארכו (C) עם התרחבות β-cat (C'), בעוד שתאי kd החלו לעבור אפופטוזיס (D), בדומה לעוברים שעברו מוטציה גבוהה והראו β-cat משופר ביותר.מכתים (ד').לאחר הפעלת מסלול ה-PI3K-AKT, תאי הבקרה נותרו קוביים (E) ובעלי צביעה רגילה של β-cat (E'), בעוד שתאי kd הראו צביעת תאים משופרת משמעותית (F) ו- β-cat (F'), דבר המעיד על כך. (ז) מידת השינוי בצורת התא ב-(AF) כמתה באמצעות יחס העגולות התא (CCR) של הממד הארוך ביותר (אורך) והממד האנכי המקביל (רוחב) באמצעות תוכנת MetaMorph.תאי SPECC1L-kd שלא טופלו (NT) (CCR = 3.46) היו ארוכים משמעותית מתאי ביקורת (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).עיכוב של Wort של מסלול PI3K-AKT בתאי בקרה היה מספיק כדי לגרום להתארכות דומה בצורת התא (CCR=3.61, p<2.4×10-9).באופן דומה, הפעלת AKT על ידי SC-79 בתאי SPECC1L-kd החזירה את התארכות התא לרמות בקרה (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).טיפול Wortmannin בתאי SPECC1L-kd הביא לאפופטוזיס מוגבר אך ללא עלייה נוספת בשינוי צורת התא (CCR=3.60) בהשוואה ל-kd לא מטופל (CCR=3.46, ns) או תאי ביקורת שטופלו בוורטמנין (3.61) שנצפו ב.ns = לא משנה.+/- מדידות SEM עבור 50 תאים מוצגות.הבדלים סטטיסטיים חושבו באמצעות מבחן t של Student.
(א) ייצוג סכמטי של עיכוב והפעלה של מסלול PI3K-AKT וכתוצאה מכך שינויים AJ והצלה, בהתאמה.(ב) מודל מוצע לייצוב חלבון AKT על ידי SPECC1L.
CNCCs קדם-מיגרטוריים דורשים תמוגה של AJ כדי להיפרד מתאי נוירו-אפיתל של קפל עצבי קדמי1,15,32.צביעה מוגברת של רכיבי AJ ואובדן הפצה א-סימטרית אפיקאלית-בסיסית של AJ בתאים חסרי SPECC1L הן in vitro והן in vivo, בשילוב עם הקרבה הפיזית של SPECC1L ל-β-catenin, מצביעים על כך ש- SPECC1L מתפקד כדי לשמור כראוי על יציבות מקומית של AJ עבור שרירי הארגון.ציטושלד אקטין.הקשר של SPECC1L עם ציטושלד האקטין ו-β-catenin והעלייה במספר חוטי האקטין המעובה בהיעדר SPECC1L עולה בקנה אחד עם העלייה שנצפתה בצפיפות AJ.אפשרות נוספת היא שמספר מוגבר של סיבי אקטין בתאים חסרי SPECC1L מוביל לשינוי במתח הבין תאי.מכיוון שהלחץ הסלולרי משפיע על הדינמיקה של AJ 33, שינויי מתח יכולים לגרום ל-AJ 34 מפוזר יותר.אז כל שינוי ישפיע על שכבות CNCC.
Wnt1 מתבטא בקפלים העצביים המוקדמים שיוצרים תאי ציצה עצביים.לפיכך, מעקב אחר שושלת Wnt1-cre מסמן את NCC35 לפני ונדידה כאחד.עם זאת, Wnt1 גם מסמן שיבוטים של רקמת המוח הגבי שנגזרו גם מקפלים עצביים מוקדמים 35,36, מה שהופך אותו לסביר שהצביעה שלנו של מוטציות E9.5 עבור סמני Wnt1 בקפלים עצביים פתוחים אינה CNCC.הצביעה החיובית שלנו עבור סמני ה-NCC AP2A ו-SOX10 אישרה שהקפלים העצביים החשופים של עוברים מוטנטיים Specc11 אכן מכילים CNCC.בנוסף, מכיוון ש-AP2A ו-SOX10 הם סמנים של NCC בנדידה מוקדמת, צביעה חיובית הצביעה על כך שתאים אלה הם CNCC לאחר הגירה שאינם ניתנים לריבוד על ידי E9.5.
הנתונים שלנו מראים כי ויסות מולקולרי של AJ על ידי SPECC1L מתווכת על ידי איתות PI3K-AKT.איתות AKT מופחת בתאים ורקמות חסרי SPECC1L.ממצאים של Fantauzzo et al.לתמוך בתפקיד ישיר לאיתות PI3K-AKT במורפוגנזה קרניופציאלית.(2014) הראו כי חוסר ההפעלה של איתות PI3K-AKT מבוסס PDGFRα מוביל לפנוטיפ של חיך שסוע.אנו גם מראים שעיכוב של מסלול PI3K-AKT מספיק כדי לשנות AJ וצורת התא בתאי U2OS.בהתאם לממצאים שלנו, Cain et al.37 הראה שוויסות מטה של ​​תת-היחידה PI3K α110 בתאי האנדותל מביא לעלייה דומה בצביעה pericellular β-catenin, המכונה עלייה ב"מדד הקישוריות".עם זאת, בתאי אנדותל שחוטי האקטין שלהם כבר מאורגנים מאוד, דיכוי מסלול PI3K-AKT מביא לצורת תא רופפת.לעומת זאת, תאי SPECC1L-kd U2OS הראו צורת תא מוארכת.ההבדל הזה עשוי להיות ספציפי לסוג התא.בעוד שדיכוי איתות PI3K-AKT משפיע לצמיתות על שלד ציטו האקטין, ההשפעה על צורת התא נקבעת על ידי שינויים במתח הנגרמים משינויים בצפיפות ובארגון סיבי האקטין המרכזיים.בתאי U2OS, השתמשנו רק בשינויים בצורת התא כסמן לשינוי והחלמה של AJ חסרי SPECC1L.לסיכום, אנו משערים שעיכוב של מסלול AKT במחסור ב-SPECC1L מגביר את יציבות AJ ומפחית דלמינציה ב-CNCC.
מעניין לציין כי רמות pan-AKT הופחתו במבחנה ובאינבו בנוסף לרמות 473-AKT מזורחות בהיעדר SPECC1L, דבר המצביע על ויסות של איתות PI3K-AKT ברמת יציבות או תחלופה של חלבון AKT.הגנים SPECC1L ו-MID1, שניהם קשורים לתסמונת Opitz/GBBB, מקודדים לחלבונים המייצבים מיקרוטובולים 18,22.המנגנון שבו SPECC1L ו-MID1 מתווכים ייצוב מיקרוטובולי אינו מובן במלואו.במקרה של SPECC1L, ייצוב זה כולל אצטילציה משופרת של תת-קבוצה של מיקרוטובולים 18.ייתכן ש-SPECC1L משתמש במנגנון דומה לייצוב חלבונים אחרים כגון AKT.הוכח שאצטילציה של שאריות ליזין בחלבון AKT מובילה לירידה בלוקליזציה של הממברנה ובזרחון38.בנוסף, נדרשת Ubiquitination של שרשרת K63 באותה שארית ליזין ב-AKT עבור לוקליזציה והפעלת הממברנה שלה39,40.בין מספר גורמים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני SPECC1L שזוהו במסכים שונים של שמרים דו-היברידיים בתפוקה גבוהה, ארבעה - CCDC841, ECM2942, APC ו-UBE2I43 - היו מעורבים בתחלופת חלבון או ביציבות באמצעות Ubiquitination או Sumoylation.SPECC1L עשוי להיות מעורב בשינוי פוסט-תרגום של שאריות ליזין AKT, המשפיע על יציבות AKT.עם זאת, התפקיד הקריטי של SPECC1L בלוקליזציה וביציבות של חלבון AKT נותר להבהיר.
פגמים חמורים בביטוי SPECC1L in vivo הביאו לצביעה מוגברת של סמן AJ ולכיסוי CNCC פגום, כמו גם עלייה באפופטוזיס וקטלניות עוברית מוקדמת.דיווחים קודמים הראו שמוטנטים של עכברים עם רמות מוגברות של אפופטוזיס קשורים למומים בצינור העצבי 44,45,46,47 ולפגמים קרניופציאליים48.הוצע שמוות מוגזם של תאים בקפלים העצביים או בקשתות הלוע עלול לגרום למספר לא מספיק של תאים הנדרשים לתנועה מורפוגנטית תקינה 48,49,50.לעומת זאת, שורות תאים חסרות SPECC1L שלנו עם ביטוי SPECC1L מופחת במידה בינונית הראו רק שינויים ב-AJ ללא עדות למוות תאים מוגבר.עם זאת, עיכוב כימי של מסלול PI3K-AKT בתאי Kd אלה הביא לאפופטוזיס מוגבר.לפיכך, ירידה מתונה בביטוי או בתפקוד SPECC1L מבטיחה את הישרדות התא.זה עולה בקנה אחד עם התצפית שעוברים נדירים של מוטציה Specc11 שנמלטים ממעצר ברחוב.E9.5 - אולי בגלל יעילות מופחתת של לכידת גנים - מסוגלים לסגור את הצינורות העצבים שלהם ולעצור מאוחר יותר בפיתוח, לעתים קרובות עם פגמים קרניופציאליים (איור S3).כמו כן עולה בקנה אחד עם ההתרחשות הנדירה של עוברי Specc1l הטרוזיגוטיים עם הפרעות גולגולתיות - כנראה עקב יעילות מוגברת של לכידת גנים - וכן הממצא בדג הזברה שבו אחד משני האורתולוגים SPECC1L (specc1lb) גורם לפנוטיפים עובריים מאוחרים, כולל אובדן של לסתות תחתונות ושסעים דו-צדדיים51.לפיכך, מוטציות הטרוזיגוטיות של אובדן תפקוד של SPECC1L המזוהות בחולים אנושיים עלולות לגרום לליקויים קטנים בתפקוד SPECC1L במהלך מורפוגנזה קרניופציאלית, מספיק כדי להסביר את השסעים האורופציאליים שלהם.ויסות מבוסס SPECC1L של מגעים בין-תאיים עשוי גם למלא תפקיד בפלטוגנזה והיתוך של קשתות הלוע.מחקרים נוספים של תפקוד SPECC1L יסייעו להבהיר את התפקיד של מגע בין-תא זמני ב-CNCC במהלך סגירת הצינור העצבי בתנועתיות של תאי נוירו-אפיתל ומורפוגנזה קרניופציאלית.
תאי בקרת אוסטאוסרקומה U2OS ותאי SPECC1L-kd תוארו בעבר (Saadi et al., 2011).נוגדנים נגד SPECC1L אופיינו גם בעבר (Saadi et al., 2011).נוגדנים נגד β-קטנין (ארנב; 1:1000; סנטה קרוז, דאלאס, טקסס) (עכבר; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), מיוזין IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, קולו.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, סן דייגו , קליפורניה), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), caspase 3 מפוצל (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ו-β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) שימש כמתואר..חוטי האקטין נצבעו ב-Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
תאי ביקורת U2OS ותאי SPECC1L-kd תורבו ב-DMEM סטנדרטי גבוה של גלוקוז בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (Life Technologies, Carlsbad, CA).עבור שינויים ב-AJ, 2 x 105 תאים נזרעו על זכוכית שטופלה ב-0.1% ג'לטין חזיר (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ונצפו בשינויים בצורת התא.תאים נאספו בנקודות זמן מסומנות שונות: 4 שעות לאחר זריעה (t = 1), 24 שעות לאחר זריעה (t = 2), מפגש ללא שינוי בצורת התא (t = 3), שינוי בצורת התא (t = 4) , 24 שעות לאחר שינוי צורת התא (t=5) ו-48 שעות לאחר שינוי צורת התא (t=6) (איור 1, 2, 3).כדי לווסת את מסלול PI3K-AKT, תאים תורבו בריכוזים המצוינים עם מעכב PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) או מפעיל SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).המדיום המכיל את הכימיקלים הוחלף מדי יום.
הקלטות מסגרת אחר מסגרת בוצעו על תאי בקרה חיה ותאי KD בתנאי תרבית רגילים, ותמונות ניגודיות פאזה נאספו כל 10 דקות למשך 7 ימים.התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ הפוך Leica DM IRB הנשלט על ידי מחשב המצויד בבמה מכנית ואובייקטיבי N-PLAN 10 × המחוברים למצלמת QImaging Retiga-SRV.במהלך ההדמיה, תרביות תאים נשמרו ב-37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2.
שני קווי תאי ES של מלכודת גנים DTM096 ו-RRH048 ממרכז משאבי העכבר האזורי (UC Davis, CA) שימשו ליצירת קווי עכבר חסרים Specc11, המכונים Specc1lgtDTM096 ו- Specc1lgtRRH046.בקצרה, 129/REJ ES תאי הוזרקו לתוך בלסטוציסטים C57BL6.העכברים הזכרים הכימריים שהתקבלו גודלו עם נקבות עכברי C57BL6 כדי לזהות צאצאים עם צבע מעיל אגוטי.נוכחותם של תוספות וקטור מלכודת גנים שימשה לזיהוי הטרוזיגוטים.עכברים נשמרו על רקע מעורב של 129/REJ;C57BL6.המיקום של אתר ההחדרה של וקטור המלכודת הגנטית אושר על ידי RT-PCR, רצף גנום והשלמה גנטית (איור משלים 1).כדי להתחקות אחר שושלת ה-CNCC של עכברי Specc1lGT הטרוזיגוטיים כפולים, הוצלבו עכברי ROSAmTmG (#007576) ו-Wnt1-Cre (#003829) (מעבדת ג'קסון, בר הארבור, ME) כדי לייצר את אלל ROSAmTmG ו-Wnt1-Cre ב-embrcyol embrcyol.כל הניסויים בעכברים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס.
עוברים נקבעו ב-(1% פורמלדהיד, 0.2% גלוטראלדהיד, 2 מ"מ MgCl2, 0.02% NP-40, 5 מ"מ EGTA) למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר קיבוע בתמיסת צביעה X-gal (5 מ"מ אשלגן ferricyanide, 5 מ"מ אשלגן ferrocyanide, 2 מ"מ MgCl2, 0.01% נתרן דיאוקסיכולאט, 0.02% NP-40, 1 מ"ג/מ"ל X-gal) פיתוח הכתם בוצע ב-37°C .°C תוך 1-6 שעות.עוברים תוקנו לאחר מכן ב-4% PFA והוצגו.
עבור סופג מערבי, תאים עברו lysis במאגר תמוגה פסיבי (Promega, Fitchburg, WI) בתוספת תערובת של מעכבי HALT פרוטאז (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).הליסאטים עובדו על גבי ג'לים מוכנים של 12% פוליאקרילאמיד Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) והועברו לממברנות Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).הממברנות נחסמו בחלב 5% ב-PBS המכיל 0.1% Tween.נוגדנים הודגרו במשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס או למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.ריאגנט Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) שימש להפקת אותות.לצביעה חיסונית, העוברים נקבעו למשך הלילה ב-4% PFA/PBS ושמרו בהקפאה.חתכים להקפאה של רקמות נחסמו ב-PBS המכיל 1% סרום עיזים תקין (Thermo Scientific, Waltham, MA) ו-0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ולאחר מכן הודגרו ב-4°C באינקובטור במהלך לַיְלָה.עם נוגדן נוגדן ונוגדן משני ניאון (1:1000) למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.קטעים מוכתמים הונחו במדיום זהב ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) והתקבלו תמונות שטוחות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי Leica TCS SPE.כל צביעה חיסונית בוצעה כשלושה ניסויים עצמאיים על חתכים צולבים של לפחות שני עוברים מוטנטים.מוצג ניסוי מייצג.
תאים הודגרו במאגר RIPA שונה (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% גליצרול, 2 mM EDTA ומעכבי פרוטאז HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) בקצרה, הליסאטים טוהרו מראש עם חרוזים מגנטיים של חלבון G (Life Technologies, קרלסבאד, קליפורניה) ולאחר מכן הודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. עם חרוזי חלבון G נגד SPECC1L או IgG שימשו לחילוץ SPECC1L ו-Western blotting בוצע באמצעות האנטי. נוגדן -β-catenin שתואר לעיל ניסויי השיתוף ב-IP המוצגים מייצגים ארבעה ניסויים עצמאיים.
תאים מתורבתים קבועים או רקמות עובריות של עכברים סופקו למרכז למיקרוסקופיה אלקטרונית במרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס.בקצרה, דגימות הוטמעו בשרף EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, פורט וושינגטון, הרשות הפלסטינית), פולימרו למשך הלילה ב-60 מעלות צלזיוס, וחתכו ב-80 ננומטר באמצעות אולטרה-מיקרוטום Leica UC7 המצויד בלהב יהלום.החתכים הוצגו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת JEOL JEM-1400 המצויד באקדח 100 קילו וולט Lab6.
כיצד לצטט מאמר זה: Wilson, NR et al.מחסור ב-SPECC1L מוביל ליציבות מוגברת של מפרקים שחבורים ולהפחתת דלמינציה של תאי ציצה עצבית גולגולתית.המדע.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.אינדוקציה ובידול של הקודקוד העצבי.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.תאי קרניאל עצבי בתנועה: תפקידם בהתפתחות גולגולתי.כתב העת האמריקאי לגנטיקה רפואית.חלק א' 155א, 270–279, דואי:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: צמיחתו והתפתחותו במשך 20 שנה.רוֹפֵא יְלָדִים.פָּתוֹלוֹגִיָה.מַעבָּדָה.תרופה.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU ו-Noten MM פריצת דרך בגנטיקה של שסעים אורופציאליים.מגמות ברפואה מולקולרית 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. and Riley, FM מנגנונים מולקולריים של נדידת תאי קודקוד עצבית גולגולת ודפוסים במהלך התפתחות גולגולת פנים.Development 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH ומורי, JK שפה וחך שסועים: הבנת השפעות גנטיות וסביבתיות.הערה טבעית.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
אינגרם, CR et al.מורפוגנזה לא תקינה של העור, הגפיים והאזור הקרניופציאלי בעכברים חסרי אינטרפרון מווסת פקטור-6 (Irf6).לאומי ג'נט.38, 1335–1340, דואי: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.מוטציות דומיננטיות ב-GRHL3 גורמות לתסמונת ואן דר וורד ופוגעות בהתפתחות של הפרידרם הפה.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ ו-Juriloff, DM עדכן את רשימת המוטנטים של עכברים עם פגמים בסגירת צינור עצבי והתקדמות לקראת הבנה גנטית מלאה של סגירת צינור עצבי.חקירת מומים מולדים.חלק א', טרטולוגיה קלינית ומולקולרית 88, 653–669, דואי: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. איתות PDGFRalpha בתיווך PI3K מסדיר את ההישרדות והשגשוג בהתפתחות השלד דרך מסלול תוך תאי תלוי p53.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND ומרדוק, JN Disheveled: קשר של התרחבות מתכנסת לסגירת צינור עצבי.מגמות בנוירולוגיה.26, 453–455, דואי: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).