304 נירוסטה מרותך צינור מפותל / זומפונט זמי צינור, פוטנציאל ביו-סינטטי של המיקרוביום הימי העולמי

תודה שביקרת ב-Nature.com.אתה משתמש בגרסת דפדפן עם תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בנוסף, כדי להבטיח תמיכה שוטפת, אנו מציגים את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
סליידרים המציגים שלושה מאמרים בכל שקופית.השתמש בלחצנים 'הקודם' וה'הבא' כדי לעבור בין השקופיות, או בלחצני בקר השקופיות שבקצה כדי לעבור בין כל שקופית.

תיאור מוצר מפורט

304 נירוסטה מרותך צינור מפותל / צינורות
1. מפרט: צינור סליל נירוסטה / צינורות
2. סוג: מרותך או חלק
3. תקן: ASTM A269, ASTM A249
4. צינור סליל נירוסטה OD: 6 מ"מ עד 25.4 מ"מ
5. אורך: 600-3500 מ"מ או לפי דרישת הלקוח.
6. עובי דופן: 0.2 מ"מ עד 2.0 מ"מ.

7. סובלנות: OD: +/-0.01 מ"מ;עובי: +/-0.01%.

8. גודל חור פנימי של סליל: 500MM-1500MM (ניתן להתאים בהתאם לדרישות הלקוח)

9. גובה סליל: 200 מ"מ-400 מ"מ (ניתן להתאמה לפי דרישות הלקוח)

10. משטח: בהיר או מחושל
11. חומר: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, סגסוגת 625, 825, 2205, 2507 וכו'.
12. אריזה: שקיות ארוגות במארז עץ, משטח עץ, פיר עץ, או לפי דרישת הלקוח
13. מבחן: רכיב כימי, חוזק תפוקה, חוזק מתיחה, מדידת קשיות
14. אחריות: בדיקת הצד השלישי (לדוגמה: SGS TV ) וכו'.
15. יישום: קישוט, רהיטים, הובלת נפט, מחליף חום, ייצור מעקות, ייצור נייר, רכב, עיבוד מזון, רפואי וכו'.

קהילות מיקרוביאליות טבעיות מגוונות מבחינה פילוגנטית ומטבולית.בנוסף לקבוצות של אורגניזמים שאינן נחקרות1, מגוון זה טומן בחובו גם פוטנציאל עשיר לגילוי אנזימים ותרכובות ביוכימיות בעלי משמעות אקולוגית וביוטכנולוגית2,3.עם זאת, לימוד המגוון הזה כדי לקבוע את המסלולים הגנומיים המסנתזים תרכובות כאלה וקושרים אותן למארחים שלהם נותר אתגר.הפוטנציאל הביוסינתטי של מיקרואורגניזמים באוקיינוס ​​הפתוח נותר לא ידוע במידה רבה בשל מגבלות בניתוח נתוני רזולוציית הגנום המלא בקנה מידה עולמי.כאן אנו חוקרים את המגוון והמגוון של צבירי גנים ביו-סינתטיים באוקיינוס ​​על ידי שילוב של כ-10,000 גנומים מיקרוביאליים מתאי תרבות ותאים בודדים עם יותר מ-25,000 גנומים ששוחזרו לאחרונה מלמעלה מ-1,000 דגימות מי ים.מאמצים אלה זיהו כ-40,000 צבירי גנים ביו-סינתטיים חדשים, שחלקם נמצאו בקבוצות פילוגנטיות שלא חשדו בעבר.באוכלוסיות אלו, זיהינו שושלת מועשרת בצבירי גנים ביו-סינתטיים ("Candidatus Eudormicrobiaceae") שהשתייכו לקבוצת חיידקים לא מעובדת וכללו כמה מהמיקרואורגניזמים המגוונים ביותר מבחינה ביו-סינתטית בסביבה זו.מתוכם, אפינו את מסלולי ה-phosphatase-peptide ו-pytonamide, תוך זיהוי מקרים של מבנה תרכובות ביו-אקטיביות יוצאות דופן ואנזימולוגיה, בהתאמה.לסיכום, מחקר זה מדגים כיצד אסטרטגיות המבוססות על מיקרוביום יכולות לאפשר חקירה של אנזימים ומזונות טבעיים שלא תוארו בעבר במיקרוביוטה ובסביבה לא מובנים.
מיקרובים מניעים מחזורים ביו-גיאוכימיים גלובליים, שומרים על קורי מזון ושומרים על בריאות צמחים ובעלי חיים5.המגוון הפילוגנטי, המטבולי והתפקודי העצום שלהם מייצג פוטנציאל עשיר לגילוי של taxa1 חדשים, אנזימים ותרכובות ביוכימיות, כולל מוצרים טבעיים6.בקהילות אקולוגיות, מולקולות אלו מספקות למיקרואורגניזמים מגוון פונקציות פיזיולוגיות ואקולוגיות, מתקשורת ועד תחרות 2, 7 .בנוסף לתפקודיהם המקוריים, מוצרים טבעיים אלו ומסלולי הייצור המקודדים גנטית מספקים דוגמאות ליישומים ביוטכנולוגיים וטיפוליים2,3.הזיהוי של מסלולים וקשרים כאלה הוקל מאוד על ידי חקר חיידקים מתורבתים.עם זאת, מחקרים טקסונומיים של סביבות טבעיות הראו שרובם המכריע של המיקרואורגניזמים לא תורבת8.הטיה תרבותית זו מגבילה את יכולתנו לנצל את המגוון התפקודי המקודד על ידי חיידקים רבים4,9.
כדי להתגבר על מגבלות אלו, ההתקדמות הטכנולוגית בעשור האחרון אפשרה לחוקרים לרצף ישירות (כלומר, ללא תרבית קודמת) קטעי DNA מיקרוביאליים מקהילות שלמות (מטגנומיקה) או תאים בודדים.היכולת להרכיב את המקטעים הללו לשברי גנום גדולים יותר ולשחזר מספר גנומים מורכבים מטאנומית (MAGs) או גנומים בודדים מוגברים (SAGs), בהתאמה, פותחת הזדמנות חשובה למחקרים טקסוצנטריים של המיקרוביום (כלומר, קהילות מיקרוביאליות והמיקרוביום).לסלול נתיבים חדשים.חומר גנטי משלו בסביבה נתונה) 10,11,12.ואכן, מחקרים עדכניים הרחיבו מאוד את הייצוג הפילוגנטי של המגוון המיקרוביאלי על כדור הארץ1, 13 וחשפו הרבה מהמגוון הפונקציונלי בקהילות מיקרוביאליות בודדות שלא כוסו קודם לכן על ידי רצפי התייחסות גנום של מיקרואורגניזמים תרבותיים (REFs)14.היכולת למקם מגוון תפקודי שלא התגלה בהקשר של הגנום המארח (כלומר, רזולוציית הגנום) היא קריטית לניבוי קווים מיקרוביאליים שטרם אופיינו, המקודדים ככל הנראה מוצרים טבעיים חדשים15,16 או למעקב אחר תרכובות כאלה חזרה ליצרן המקורי17.לדוגמה, גישה משולבת של ניתוח מטאנומי וגנומי חד-תא הובילה לזיהוי של Candidatus Entotheonella, קבוצה של חיידקים הקשורים לספוג עשיר מבחינה מטבולית, כיצרנים של מגוון פוטנציאלים של תרופות18.עם זאת, למרות הניסיונות האחרונים לחקירה גנומית של קהילות מיקרוביאליות מגוונות, 16,19 יותר משני שלישים מהנתונים המטאנומיים העולמיים עבור האוקיינוס ​​הגדול ביותר של מערכות אקולוגיות בכדור הארץ16,20 עדיין חסרים.לפיכך, באופן כללי, הפוטנציאל הביוסינתטי של המיקרוביום הימי והפוטנציאל שלו כמאגר של מוצרים אנזימטיים וטבעיים חדשים נותרו לא נחקר במידה רבה.
כדי לחקור את הפוטנציאל הביוסינתטי של מיקרוביומים ימיים בקנה מידה עולמי, אספנו תחילה גנומים מיקרוביאליים ימיים שהתקבלו באמצעות שיטות תלויות תרבות ולא תרבותיות כדי ליצור מסד נתונים נרחב של פילוגנטיות ותפקוד גנים.בדיקה של מסד נתונים זה גילתה מגוון רחב של צבירי גנים ביו-סינתטיים (BGCs), שרובם שייכים למשפחות שעדיין לא מאופיינות באשכול גנים (GCF).בנוסף, זיהינו משפחת חיידקים לא ידועה המציגה את המגוון הידוע הגבוה ביותר של BGCs באוקיינוס ​​הפתוח עד כה.בחרנו שני מסלולי סינתזה ריבוזומלית ו-Peptide modified post-translationally (RiPP) לאימות ניסיוני בהתבסס על ההבדלים הגנטיים שלהם מהמסלולים הידועים כיום.האפיון הפונקציונלי של מסלולים אלה חשף דוגמאות בלתי צפויות של אנזימולוגיה כמו גם תרכובות חריגות מבחינה מבנית עם פעילות מעכבת פרוטאז.
בתחילה, שאפנו ליצור משאב נתונים גלובלי לניתוח הגנום, תוך התמקדות ברכיבים החיידקיים והארכאיים שלו.לשם כך, ריכזנו נתונים מטאנומיים ו-1038 דגימות מי ים מ-215 אתרי דגימה בתפוצה גלובלית (טווח קו רוחב = 141.6°) ומספר שכבות עמוקות (מ-1 עד 5600 מ' עומק, המכסים את האזורים הפלגיים, המזופלגיים והתהום).רקע21,22,23 (איור 1a, נתונים מורחבים, איור 1a וטבלה משלימה 1).בנוסף לאספקת כיסוי גיאוגרפי רחב, דגימות אלו שסוננו באופן סלקטיבי אפשרו לנו להשוות בין מרכיבים שונים של המיקרוביום הימי, כולל עשיר בנגיפים (<0.2 מיקרומטר), עשיר בפרוקריוטים (0.2-3 מיקרומטר), עשיר בחלקיקים (0.8 מיקרון). ).-20 מיקרומטר) ומושבות מדוללות וירוסים (>0.2 מיקרומטר).
א, סה"כ 1038 גנומים זמינים לציבור (מטגנומיה) של קהילות מיקרוביאליות ימיות שנאספו מ-215 מיקומים הפזורים ברחבי העולם (62°S עד 79°N ו-179°W עד 179°E.).אריחי מפה © Esri.מקורות: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ ו-Esri.ב, מטאנומים אלה שימשו לשחזור MAGs (שיטות ומידע נוסף), הנבדלים בכמות ובאיכות (שיטות) במערך הנתונים (מסומנים בצבע).ל-MAGs המשוחזרים נוספו עם גנומים זמינים לציבור (חיצוניים), כולל MAG26, SAG27 ו-REF בעבודת יד.27 הידור OMD.ג, בהשוואה לדיווחים קודמים המבוססים רק על SAG (GORG)20 או MAG (GEM)16, OMD משפרת את האפיון הגנומי של קהילות מיקרוביאליות ימיות (קצב מיפוי קריאה מטאגנומי; שיטה) פי שניים עד שלוש עם ייצוג עקבי יותר לעומק ו קו רוחב..<0.2, n=151, 0.2-0.8, n=67, 0.2-3, n=180, 0.8-20, n=30, >0.2, n=610, <30°, n=132, 30-60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. ד, קיבוץ OMD לרמת צבירי מינים (95% זהות נוקלאוטיד ממוצעת) מזהה סך של כ-8300 מינים, יותר ממחציתם לא אופיינו בעבר על פי ביאורים טקסונומיים באמצעות GTDB (גרסה 89) e, סיווג מינים לפי סוג גנום הראה ש-MAG, SAG ו-REF משלימים זה את זה היטב בשיקוף המגוון הפילוגנטי של המיקרוביום הימי.בפרט, 55%, 26% ו-11% מהמינים היו ספציפיים ל-MAG, SAG ו-REF, בהתאמה.BATS, Bermuda Atlantic Time Series;GEM, גנומים של המיקרוביום של כדור הארץ;GORG, גנום התייחסות עולמי לאוקיאנוס;HOT, סדרת זמן באוקיינוס ​​הוואי.
באמצעות מערך נתונים זה, שחזרנו סך של 26,293 MAGs, בעיקר חיידקים וארכיאליים (איור 1b ונתונים מורחבים, איור 1b).יצרנו את ה-MAG הללו ממכלולים מדגימות מטאנומיות נפרדות ולא מאוחדות כדי למנוע קריסה של שונות רצף טבעית בין דגימות ממקומות או נקודות זמן (שיטות) שונות.בנוסף, קיבצנו מקטעים גנומיים בהתבסס על מתאמי השכיחות שלהם על פני מספר רב של דגימות (מ-58 עד 610 דגימות, תלוי בסקר; שיטה).מצאנו שזהו שלב שלוקח זמן אך חשוב 24 שדילג עליו במספר עבודות שחזור MAG16, 19, 25 בקנה מידה גדול ומשפר משמעותית את הכמות (פי 2.7 בממוצע) והאיכות (+20% בממוצע) של גנום.משוחזר מהמטאנום הימי שנחקר כאן (נתונים מורחבים, איור 2א ומידע נוסף).בסך הכל, מאמצים אלה הביאו לעלייה של פי 4.5 ב-MAG של חיידקים ימיים (פי 6 אם רק מתחשבים ב-MAG באיכות גבוהה) בהשוואה למשאב ה-MAG המקיף ביותר הקיים כיום16 (שיטות).סט ה-MAG החדש הזה ששולב אז עם 830 MAG26s, 5969 SAG27s ו-1707 REFs שנבחרו ביד.עשרים ושבעה מינים של חיידקים ימיים וארכיאה היוו אוסף קומבינטורי של 34,799 גנומים (איור 1ב).
לאחר מכן הערכנו את המשאב החדש שנוצר כדי לשפר את יכולתו לייצג קהילות מיקרוביאליות ימיות ולהעריך את ההשפעה של שילוב סוגי גנום שונים.בממוצע, מצאנו שהוא מכסה כ-40-60% מהנתונים המטאנומיים הימיים (איור 1c), פי שניים עד שלושה מהכיסוי של דוחות קודמים של MAG בלבד הן בעומק והן בקו רוחב More serial 16 או SAG20.בנוסף, כדי למדוד באופן שיטתי את המגוון הטקסונומי באוספים מבוססים, ביארנו את כל הגנומים באמצעות ערכת הכלים (שיטות) של מאגר הטקסונומיה של הגנום (GTDB) והשתמשנו בזהות נוקלאוטידים ממוצעת של 95%.28 לזיהוי 8,304 צבירי מינים (מינים).שני שלישים מהמינים הללו (כולל קלאדים חדשים) לא הופיעו בעבר ב-GTDB, מתוכם 2790 התגלו באמצעות MAG ששוחזר במחקר זה (איור 1ד).בנוסף, מצאנו שסוגים שונים של גנומים משלימים מאוד: 55%, 26% ו-11% מהמינים מורכבים לחלוטין מ-MAG, SAG ו-REF, בהתאמה (איור 1ה).בנוסף, MAG כיסה את כל 49 הסוגים שנמצאו בעמוד המים, בעוד ש-SAG ו-REF ייצגו רק 18 ו-11 מהם, בהתאמה.עם זאת, SAG מייצג טוב יותר את המגוון של הקלאדים הנפוצים ביותר (נתונים מורחבים, איור 3a), כגון Pelagic Bacteriales (SAR11), כאשר SAG מכסה כמעט 1300 מינים ו-MAG רק 390 מינים.יש לציין, REFs רק לעתים רחוקות חפפו עם MAGs או SAGs ברמת המין וייצגו יותר מ-95% מכ-1000 הגנומים שלא נמצאו במערכות המטגנומיות של האוקיינוס ​​הפתוח שנחקרו כאן, בעיקר עקב אינטראקציות עם סוגים אחרים של דגימות ימיות מייצגות מבודדות (למשל משקעים) .או שותף מארח).כדי להפוך אותו לזמין באופן נרחב לקהילה המדעית, ניתן להשוות את משאב הגנום הימי הזה, הכולל גם שברים לא מסווגים (למשל, מפאג'ים חזויים, איים גנומיים ומקטעי גנום שאין מספיק נתונים עבור שחזור MAG), לנתונים טקסונומיים. .גישה להערות יחד עם תפקוד גנים ופרמטרים הקשריים במסד הנתונים של אוקיינוס ​​מיקרוביולוגיה (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
לאחר מכן יצאנו לחקור את העושר והחידוש של הפוטנציאל הביוסינתטי במיקרוביומים של אוקיינוס ​​פתוח.לשם כך, השתמשנו לראשונה ב-antiSMASH עבור כל ה-MAG, SAGs ו-REFs שנמצאו ב-1038 מטאנומים ימיים (שיטות) כדי לחזות סך של 39,055 BGCs.לאחר מכן קיבצנו אותם ל-6907 GCFs לא מיותרים ו-151 אוכלוסיות אשכולות גנים (GCCs; טבלה משלימה 2 ושיטות) כדי להסביר יתירות אינהרנטית (כלומר, אותו BGC יכול להיות מקודד במספר גנומים) ופיצול נתונים מטאנומי של BGCs מרוכז.BGCs לא שלמים לא הגדילו באופן משמעותי, אם בכלל (מידע משלים), את מספר ה-GCFs וה-GCCs, בהתאמה, המכילים לפחות חבר BGC שלם אחד ב-44% ו-86% מהמקרים.
ברמת GCC, מצאנו מגוון רחב של RiPPs חזוי ומוצרים טבעיים אחרים (איור 2a).ביניהם, למשל, ארילפוליאנים, קרוטנואידים, אקטוינים וסידרופורים שייכים ל-GCCs עם תפוצה פילוגנטית רחבה ושכיחות גבוהה במטאנומים אוקייניים, מה שעשוי להצביע על הסתגלות רחבה של מיקרואורגניזמים לסביבה הימית, כולל עמידות למיני חמצן תגובתיים. מתח חמצוני ואוסמוטי..או ספיגת ברזל (מידע נוסף).מגוון תפקודי זה מנוגד לניתוח עדכני של כ-1.2 מיליון BGCs בין כ-190,000 גנומים המאוחסנים במסד הנתונים של NCBI RefSeq (BiG-FAM/RefSeq, להלן RefSeq)29, אשר הראה כי פפטידים לא-ריבוזומליים Synthetase (NRPS) ו-polyketide (PKS) BGCs (מידע משלים).מצאנו גם 44 (29%) GCCs הקשורים רק רחוק לכל RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4; איור 2a ושיטות) ו-53 (35%) GCCs רק ב-MAG, מה שמדגיש את הפוטנציאל כדי לזהות כימיקלים שלא תוארו בעבר ב-OMD.בהתחשב בכך שכל אחד מה-GCCs הללו מייצג ככל הנראה פונקציות ביוסינתטיות מגוונות ביותר, ניתחנו עוד נתונים ברמת GCF במאמץ לספק קיבוץ מפורט יותר של BGCs שצפוי לקודד עבור מוצרים טבעיים דומים29.סך של 3861 (56%) GCFs שזוהו לא חופפו ל-RefSeq, ויותר מ-97% מה-GCFs לא היו נוכחים ב-MIBiG, אחד ממאגרי המידע הגדולים ביותר של BGCs מאומתים בניסוי (איור 2b).למרות שזה לא מפתיע לגלות מסלולים חדשים פוטנציאליים רבים בהגדרות שאינן מיוצגות היטב על ידי גנום הייחוס, השיטה שלנו לסילוק BGCs לתוך GCFs לפני benchmarking שונה מדוחות קודמים 16 ומאפשרת לנו לספק הערכה בלתי משוחדת של חידוש.רוב המגוון החדש (3012 GCF או 78%) תואם לטרפנים חזויים, RiPP או מוצרים טבעיים אחרים, ורובם (1815 GCF או 47%) מקודדים בסוגים לא ידועים בשל הפוטנציאל הביוסינתטי שלהם.בניגוד לאשכולות PKS ו-NRPS, BGCs קומפקטיים אלו נוטים פחות להתפצל במהלך הרכבה מטאגנומית 31 ולאפשר אפיון פונקציונלי עתיר זמן ומשאבים יותר של המוצרים שלהם.
סך של 39,055 BGCs קובצו ל-6,907 GCFs ו-151 GCCs.א, ייצוג נתונים (פנימי חיצוני).מקבץ היררכי של מרחקי BGC מבוסס על GCC, 53 מהם קבועים על ידי MAG בלבד.ה-GCC מכיל BGCs מטקסות שונות (תדר שער שעבר טרנספורמציה) ומחלקות BGC שונות (גודל העיגול מתאים לתדר שלו).עבור כל GCC, השכבה החיצונית מייצגת את מספר BGCs, השכיחות (אחוז הדגימות) והמרחק (מרחק קוסינוס BGC מינימלי (min(dMIBiG))) מ-BG-FAM ל-BGC.GCCs עם BGCs הקשורים קשר הדוק BGCs מאומת ניסיוני (MIBiG) מודגשים בחצים.ב השוואה של GCF עם BGCs חזויים (BiG-FAM) ומאומתים בניסוי (MIBiG), נמצאו 3861 GCFs חדשים (d–>0.2).רוב (78%) של אלה מקודדים עבור RiPP, טרפנים ומוצרים טבעיים אחרים.ג, כל הגנומים ב-OMD שנמצאו ב-1038 מטאנומים ימיים הוצבו בעץ הבסיס של GTDB כדי להראות את הכיסוי הפילוגנטי של ה-OMD.קלידים ללא כל גנום ב-OMD מוצגים באפור.מספר BGCs מתאים למספר הגדול ביותר של BGC חזוי לכל גנום בקלייד נתון.לשם הבהירות, 15% האחרונים מהצמתים ממוטטים.חיצים מצביעים על קלידים עשירים ב-BGC (>15 BGC), למעט Mycobacterium, Gordonia (שני רק ל-Rhodococcus) ו-Crocosphaera (שני רק ל-Synechococcus).ד, לא ידוע ג.Eremiobacterota הראה את המגוון הביוסינתטי הגבוה ביותר (מדד שאנון מבוסס על סוג המוצר הטבעי).כל להקה מייצגת את הגנום עם הכי הרבה BGCs במין.T1PKS, PKS סוג I, T2/3PKS, PKS סוג II וסוג III.
בנוסף לעושר ולחידוש, אנו חוקרים את המבנה הביוגיאוגרפי של הפוטנציאל הביוסינתטי של המיקרוביום הימי.קיבוץ דגימות לפי התפלגות מספר העתקים מטגנומית ממוצעת של GCF (שיטות) הראה שקהילות בקו רוחב נמוך, משטח, עשירות בפרוקריוטים ועניות בווירוסים, בעיקר ממים משטחים או עמוקים יותר שטופי שמש, היו עשירות בטרפנים RiPP ו-BGC.לעומת זאת, קהילות עשירות בקוטב, בים עמוק, וירוסים וחלקיקים היו קשורות לשפע גבוה יותר של NRPS ו-PKS BGC (נתונים מורחבים, איור 4 ומידע נוסף).לבסוף, מצאנו כי קהילות טרופיות ופלגיות שנחקרו היטב הן המקורות המבטיחים ביותר של טרפנים חדשים (איור נתונים מוגדל).הפוטנציאל הגבוה ביותר עבור PKS, RiPP ומוצרים טבעיים אחרים (איור 5a עם נתונים מורחבים).
כדי להשלים את המחקר שלנו על הפוטנציאל הביוסינתטי של מיקרוביומים ימיים, שאפנו למפות את התפוצה הפילוגנטית שלהם ולזהות קלידים חדשים מועשרים ב-BGC.לשם כך, הצבנו את הגנום של חיידקים ימיים לתוך עץ פילוגנטי חיידקי וארכאי מנורמל GTDB13 והנחתנו את המסלולים הביוסינתטיים המשוערים שהם מקודדים (איור 2c).זיהינו בקלות כמה קלידים מועשרים ב-BGC (מיוצגים על ידי למעלה מ-15 BGCs) בדגימות מי ים (שיטות) הידועות בפוטנציאל הביוסינתטי שלהן, כגון ציאנובקטריה (Synechococcus) וחיידקי פרוטאוס, כגון Tistrella32,33, או משכו לאחרונה תשומת לב בשל הפוטנציאל הביוסינתטי שלהם. מוצרים טבעיים .כגון Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus ו-Planctomycetota34,35,36.מעניין לציין שמצאנו כמה שושלות שלא נחקרו בעבר בקלידים האלה.לדוגמא, המינים בעלי הפוטנציאל הביוסינתטי העשיר ביותר ב-Planctomycetota ו-Myxococcota השתייכו למסדרים ולסוגים מועמדים לא מאופיינים, בהתאמה (טבלה משלימה 3).ביחד, זה מצביע על כך שה-OMD מספק גישה למידע פילוגנטי שלא היה ידוע בעבר, כולל מיקרואורגניזמים, שעשויים לייצג יעדים חדשים לגילוי אנזים ומוצרים טבעיים.
לאחר מכן, אפיינו את ה-BGC-העשיר על ידי ספירת המספר המרבי של BGCs המקודד על ידי חבריו, אלא גם על ידי הערכת המגוון של BGCs אלה, מה שמסביר את התדירות של סוגים שונים של מוצרים מועמדים טבעיים (איור 2c ושיטות )..מצאנו כי המינים המגוונים ביותר מבחינה ביוסינתטית היו מיוצגים על ידי MAGs חיידקיים מהונדסים במיוחד במחקר זה.חיידקים אלה שייכים לסוג הבלתי מעובד Candidatus Eremiobacterota, שנותר ברובו בלתי נחקר מלבד כמה מחקרים גנומיים37,38.ראוי לציין כי "כ.הסוג Eremiobacterota נותח רק בסביבה יבשתית39 ואינו ידוע ככולל חברים מועשרים ב-BGC.כאן שחזרנו שמונה MAGs מאותו המין (זהות נוקלאוטידים > 99%) 23. לכן אנו מציעים את שם המין "Candidatus Eudoremicrobium malaspinii", על שם הנרייד (נימפת הים), מתנה יפה במיתולוגיה ובמסעות היווניות.'קה.על פי ביאור פילוגנטי 13, ל-E. malaspinii אין קרובי משפחה ידועים בעבר מתחת לרמת הרצף ולכן שייך למשפחת חיידקים חדשה שאנו מציעים "Ca.E. malaspinii" כמין הסוג ו"Ca.Eudormicrobiaceae" כשם הרשמי (מידע משלים).שחזור מטגנומי קצר של 'Ca.פרויקט הגנום E. malaspinii אושר על ידי קלט נמוך מאוד, רצף מטאנומי קריאה ארוכה והרכבה ממוקדת של דגימה בודדת (שיטות) ככרומוזום ליניארי בודד של 9.63 מגה-ביט עם שכפול של 75 קילו-בייטים.כעמימות היחידה שנותרה.
כדי לבסס את ההקשר הפילוגנטי של המין הזה, חיפשנו 40 מינים קרובים בדגימות מטגנומיות מועשרות באוקריוטים נוספים מהמשלחת של Tara Ocean באמצעות שחזור גנום ממוקד.בקצרה, קישרנו קריאה מטאנומית למקטעים גנומיים הקשורים ל-"Ca.E. malaspinii" והשערה ששיעור גיוס מוגבר במדגם זה מעיד על נוכחות של קרובי משפחה אחרים (שיטות).כתוצאה מכך, מצאנו 10 MAGs, שילוב של 19 MAGs המייצגים חמישה מינים בשלושה סוגים בתוך משפחה שהוגדרה לאחרונה (כלומר "Ca. Eudormicrobiaceae").לאחר בדיקה ידנית ובקרת איכות (נתונים מורחבים, איור 6 ומידע נוסף), מצאנו כי "Ca.מיני Eudormicrobiaceae מציגים גנומים גדולים יותר (8 Mb) ופוטנציאל ביו-סינתטי עשיר יותר (14 עד 22 BGC לכל מין) מאשר חברי "Ca" אחרים.Clade Eremiobacterota (עד 7 BGC) (איור 3a–c).
א, עמדות פילוגנטיות של חמשת 'Ca.מינים של Eudormicrobiaceae הראו עושר BGC ספציפי לקווים הימיים שזוהו במחקר זה.העץ הפילוגנטי כולל את כל 'Ca.MAG Eremiobacterota וחברי פילה אחרים (מספרי גנום בסוגריים) שסופקו ב-GTDB (גרסה 89) שימשו לרקע אבולוציוני (שיטות).השכבות החיצוניות ביותר מייצגות סיווגים ברמת המשפחה ("Ca. Eudormicrobiaceae" ו-"Ca. Xenobiaceae") וברמת המעמד ("Ca. Eremiobacteria").חמשת המינים המתוארים במחקר זה מיוצגים על ידי קודים אלפאנומריים ושמות בינומיים מוצעים (מידע משלים).ב, בסדר.מיני Eudormicrobiaceae חולקים שבעה גרעיני BGC משותפים.היעדר BGC בקלייד A2 נבע מחוסר השלמות של ה-MAG המייצג (טבלה משלימה 3).BGCs הם ספציפיים ל- "Ca.Amphithomicrobium" ו-"Ca.Amphithomicrobium" (קלידים A ו-B) אינם מוצגים.ג, כל BGCs מקודדים כ-"Ca.נמצא כי Eudoremicrobium taraoceanii מתבטא ב-623 metatranscriptome שנלקחו מהאוקיינוסים של טארה.עיגולים מלאים מציינים שעתוק פעיל.עיגולים כתומים מציינים שינויים בקפלים שעברו טרנספורמציה ב-log2 מתחת ומעל לקצב ביטוי הגנים של משק הבית (שיטות).ד, עקומות שפע יחסי (שיטות) המראות 'Ca.מינים של Eudormicrobiaceae נפוצים ברוב אגני האוקיינוס ​​ובכל עמוד המים (מפני השטח עד לעומק של לפחות 4000 מ').בהתבסס על הערכות אלה, מצאנו כי 'Ca.E. malaspinii' מהווה עד 6% מהתאים הפרוקריוטים בקהילות הקשורות לתבואות פלגיות בים עמוק.חשבנו שמין נמצא באתר אם הוא נמצא בחלק כלשהו מגודלה של שכבת עומק נתונה.IO – האוקיינוס ​​ההודי, NAO – צפון האוקיינוס ​​האטלנטי, NPO – צפון האוקיינוס ​​השקט, RS – ים סוף, SAO – דרום האוקיינוס ​​האטלנטי, SO – דרום האוקיינוס, SPO – דרום האוקיינוס ​​השקט.
לימוד השפע והתפוצה של Ca.Eudormicrobiaceae, אשר, כפי שמצאנו, שולט ברוב אגני האוקיינוס, כמו גם בכל עמודת המים (איור 3ד).באופן מקומי, הם מהווים 6% מקהילת החיידקים הימיים, מה שהופך אותם לחלק חשוב מהמיקרוביום הימי העולמי.בנוסף, מצאנו את התוכן היחסי של Ca.מיני Eudormicrobiaceae ורמות ביטוי ה-BGC שלהם היו הגבוהות ביותר בשבר המועשר האוקריוטי (איור 3c ונתונים מורחבים, איור 7), מה שמצביע על אינטראקציה אפשרית עם חלקיקים, כולל פלנקטון.תצפית זו מזכירה דמיון מסוים ל-Ca.BGCs של Eudoremicrobium המייצרים מוצרים טבעיים ציטוטוקסיים דרך מסלולים ידועים עשויים להפגין התנהגות טורפת (מידע משלים ונתונים מורחבים, איור 8), בדומה לטורפים אחרים המייצרים באופן ספציפי מטבוליטים כגון Myxococcus41.גילוי של Ca.Eudormicrobiaceae בדגימות פחות זמינות (עמוק באוקיינוס) או בדגימות איקריוטיות ולא פרוקריוטיות עשויות להסביר מדוע חיידקים אלו והמגוון הבלתי צפוי שלהם BGC נותרו לא ברורים בהקשר של מחקר מזון טבעי.
בסופו של דבר, ביקשנו לאמת באופן ניסיוני את ההבטחה של העבודה המבוססת על המיקרוביום שלנו בגילוי מסלולים חדשים, אנזימים ומוצרים טבעיים.בין המחלקות השונות של BGCs, ידוע שמסלול RiPP מקודד מגוון כימי ותפקודי עשיר בשל שינויים פוסט-תרגום שונים של פפטיד הליבה על ידי אנזימים בוגרים42.אז בחרנו שני 'Ca.Eudoremicrobium' RiPP BGCs (איורים 3b ו-4a-e) מבוססים על אותו הדבר כמו כל BGC ידוע (\(\bar{d}\)MIBiG ו-\(\bar{d}\)RefSeq מעל 0.2) .
a–c, ביטוי הטרולוגי במבחנה ומבחנים אנזימטיים במבחנה של מקבץ חדש (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) של ביוסינתזה של RiPP ספציפית למין Ca בים עמוק.E. malaspinii' הוביל לייצור מוצרים דיפוספורילטים.ג, שינויים שזוהו באמצעות MS/MS ברזולוציה גבוהה (HR) (פיצול מסומן על ידי יוני b ו-y במבנה הכימי) ו-NMR (נתונים מורחבים, איור 9).ד, פפטיד פוספוריל זה מציג עיכוב מיקרומולארי נמוך של אלסטאז נויטרופילים יונקים, שאינו נמצא בפפטיד הבקרה ובפפטיד המייבש (התייבשות הנגרמת על ידי הסרה כימית).הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים עם תוצאות דומות.לדוגמה, ביטוי הטרולוגי של צביר חדש של \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) של ביוסינתזה של חלבון מבהיר את תפקודם של ארבעה אנזימים בוגרים שמשנים את הפפטיד הליבה של 46 חומצות אמינו.שאריות נצבעות בהתאם לאתר השינוי שנחזה על ידי HR-MS/MS, תיוג איזוטופים וניתוח NMR (מידע משלים).צבע מקווקו מציין שהשינוי מתרחש בכל אחד משני השאריות.האיור הוא אוסף של מבנים הטרוגיים רבים כדי להראות את הפעילות של כל האנזימים הבוגרים על אותו גרעין.h, איור של נתוני NMR עבור עמוד השדרה אמיד N-methylation.התוצאות המלאות מוצגות באיור.10 עם נתונים מורחבים.i, מיקום פילוגנטי של אנזים אשכול חלבון FkbM בוגר בין כל תחומי ה-FkbM שנמצאו במסד הנתונים MIBiG 2.0 חושף אנזים ממשפחה זו עם פעילות N-methyltransferase (מידע משלים).מוצגים דיאגרמות סכמטיות של BGCs (a, e), מבני פפטיד מבשר (b, f), ומבנים כימיים משוערים של מוצרים טבעיים (c, g).
מסלול ה-RIPP הראשון (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) נמצא רק במינים בים עמוקים "Ca.E. malaspinii" וקודים ל-Peptide- precursor (איור 4a, b).באנזים בוגר זה, זיהינו תחום פונקציונלי יחיד הומולוגי לתחום ההתייבשות של lantipeptide synthase שבדרך כלל מזרז זרחון והסרה לאחר מכן של 43 (מידע משלים).לכן, אנו צופים שהשינוי של הפפטיד המבשר כרוך בהתייבשות דו-שלבית כזו.עם זאת, באמצעות ספקטרומטריית מסה טנדם (MS/MS) וספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), זיהינו פפטיד ליניארי פולי-פוספוריל (איור 4c).למרות שזה לא צפוי, מצאנו כמה שורות של ראיות התומכות בהיותו התוצר הסופי: שני מארחים הטרולוגיים שונים וללא התייבשות במבחני מבחנה, זיהוי של שאריות מפתח שעברו מוטציה באתר ההתייבשות הקטליטי של האנזים הבוגר.הכל משוחזר על ידי "Ca".גנום E. malaspinii (נתונים מורחבים, איור 9 ומידע נוסף) ולבסוף, הפעילות הביולוגית של המוצר הפוספוריל, אך לא הצורה המיובשת המסונתזת בצורה כימית (איור 4ד).למעשה, מצאנו כי הוא מציג פעילות מעכבת פרוטאז מיקרומולרית נמוכה נגד Neutrophil elastase, דומה למוצרים טבעיים קשורים אחרים בטווח הריכוז (IC50 = 14.3 מיקרומטר) 44, למרות העובדה שנותר להבהיר את התפקיד האקולוגי.בהתבסס על תוצאות אלו, אנו מציעים לקרוא למסלול "פוספטין".
המקרה השני הוא מסלול RiPP מורכב ספציפי ל-Ca.הסוג Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) נחזה לקודד מוצרי חלבון טבעיים (איור 4ה).מסלולים אלה הם בעלי עניין ביוטכנולוגי במיוחד בגלל הצפיפות הצפויה ומגוון השינויים הכימיים יוצאי הדופן שנקבעו על ידי האנזימים המקודדים על ידי BGCs45 קצרים יחסית.מצאנו שחלבון זה שונה מחלבונים שאופיינו בעבר בכך שהוא חסר גם את המוטיב העיקרי של NX5N של פוליסרמידים וגם את לולאת הלנתיונין של לנדאורנאמידים 46.כדי להתגבר על המגבלות של דפוסי ביטוי הטרולוגיים נפוצים, השתמשנו בהם יחד עם מערכת Microvirgula aerodenitrificans מותאמת אישית כדי לאפיין ארבעה אנזימים (שיטות) מסלול בוגר.באמצעות שילוב של MS/MS, תיוג איזוטופים ו-NMR, זיהינו אנזימים בוגרים אלו בליבת 46 חומצות אמינו של הפפטיד (איור 4f,g, נתונים מורחבים, איורים 10-12 ומידע נוסף).בין אנזימים בוגרים, אפיינו את ההופעה הראשונה של בן משפחת FkbM O-methyltransferase 47 במסלול RiPP ומצאנו באופן בלתי צפוי כי אנזים בוגר זה מציג עמוד שדרה N-methylation (איור 4h, i ומידע נוסף).למרות ששינוי זה ידוע במוצרי NRP48 טבעיים, N-methylation אנזימטי של קשרי אמיד היא תגובה מורכבת אך בעלת משמעות ביוטכנולוגית49 שעד כה עניינה את משפחת ה- RiPP של הבורוזינים.ספציפיות 50,51.הזיהוי של פעילות זו במשפחות אחרות של אנזימים ו- RiPP עשוי לפתוח יישומים חדשים ולהרחיב את המגוון התפקודי של חלבונים 52 ואת המגוון הכימי שלהם.בהתבסס על השינויים שזוהו והאורך החריג של מבנה המוצר המוצע, אנו מציעים שם מסלול "pythonamide".
הגילוי של אנזימולוגיה בלתי צפויה במשפחת אנזימים מאופיינת פונקציונלית ממחיש את ההבטחה של גנומיקה סביבתית לתגליות חדשות, וגם ממחיש את היכולת המוגבלת להסקה תפקודית המבוססת על הומולוגיה של רצף בלבד.לפיכך, יחד עם דיווחים על RiPPs פולי-פוספורילציה ביו-אקטיביים שאינם קנוניים, התוצאות שלנו מדגימות ערך עתיר משאבים אך קריטי למאמצי הביולוגיה הסינתטית כדי לחשוף במלואו את העושר התפקודי, המגוון והמבנים יוצאי הדופן של תרכובות ביוכימיות.
כאן אנו מדגימים את מגוון הפוטנציאל הביוסינתטי המקודד על ידי חיידקים והקשר הגנומי שלהם במיקרוביום הימי העולמי, ומאפשרים מחקר עתידי על ידי הפיכת המשאב המתקבל לזמין לקהילה המדעית (https://microbiomics.io/ocean/).מצאנו שחלק ניכר מהחידוש הפילוגנטי והתפקודי שלו ניתן להשיג רק על ידי שחזור MAGs ו-SAGs, במיוחד בקהילות מיקרוביאליות שאינן מנוצלות שיכולות להנחות מאמצי חיפוש ביולוגי עתידיים.למרות שנתמקד כאן ב-'Ca.Eudormicrobiaceae" בתור שושלת "מוכשרת" במיוחד מבחינה ביו-סינתטית, רבים מה-BGCs שנחזו במיקרוביוטה שלא התגלתה כנראה מקודדים לאנזימילוגים שלא תוארו בעבר, המניבות תרכובות עם פעולות משמעותיות מבחינה סביבתית ו/או ביוטכנולוגית.
מערכי נתונים מטאנומיים ממחקרי אוקיאנוגרפיה וסדרות זמן מרכזיים עם עומק רצף מספיק נכללו כדי למקסם את הכיסוי של קהילות מיקרוביאליות ימיות גלובליות באגני האוקיינוס, בשכבות עמוקות ולאורך זמן.מערכי נתונים אלה (טבלה משלימה 1 ואיור 1) כוללים מטאנומיקה מדגימות שנאספו באוקיינוסים של טארה (מועשר ויראלי, n=190; מועשר פרוקריוטי, n=180)12,22 ומשלחת BioGEOTRACES (n=480).סדרת זמן אוקיינוס ​​של הוואי (HOT, n = 68), סדרת זמן ברמודה-אטלנטית (BATS, n = 62)21 ומשלחת Malaspina (n = 58)23.קריאות רצף מכל הפרגמנטים המטאנומיים סוננו לאיכות באמצעות BBMap (v.38.71) על ידי הסרת מתאמי רצף מקריאות, הסרת קריאות שמופו לרצפי בקרת איכות (גנומים PhiX), ושימוש ב-trimq=14, maq=20 משליך איכות קריאה ירודה, maxns = 0 ו-minlength = 45. ניתוחים עוקבים הופעלו או מוזגו עם קריאות QC אם צוין (bbmerge.sh minoverlap=16).קריאות QC נורמלו (יעד bbnorm.sh = 40, minddepth = 0) לפני הבנייה באמצעות metaSPAdes (v.3.11.1 או v.3.12 אם יש צורך)53.הפיגומים שהתקבלו (שיכונו להלן פיגומים) סוננו לבסוף לפי אורך (≥1 kb).
1038 הדגימות המטגנומיות חולקו לקבוצות, ולכל קבוצת דגימות, קריאות בקרת האיכות המטגנומיות של כל הדגימות הותאמו לסוגריים של כל דגימה בנפרד, וכתוצאה מכך המספר הבא של קריאות קבוצות בסוגריים זוגיים: Tara Marine Viruses – Enriched (190×190), פרוקריוטים מועשרים (180×180), BioGEOTRACES, HOT ועטלפים (610×610) ומלספינה (58×58).המיפוי נעשה באמצעות Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 המאפשר להתאים קריאות לאתרים משניים (באמצעות דגל -a).יישורים סוננו כך שיהיו באורך של לפחות 45 בסיסים, בעלי זהות של ≥97% וטווח של ≥80% קריאות.קבצי ה-BAM שהתקבלו עובדו באמצעות הסקריפט jgi_summarize_bam_contig_depths עבור MetaBAT2 (v.2.12.1)55 כדי לספק כיסוי תוך-ובין-דגימה לכל קבוצה.לבסוף, סוגריים מקובצים כדי להגביר את הרגישות על ידי הפעלת MetaBAT2 באופן אינדיבידואלי על כל הדגימות עם –minContig 2000 ו-maxEdges 500. אנו משתמשים ב-MetaBAT2 במקום מתאגרף אנסמבל מכיוון שבבדיקות עצמאיות הוכח שהוא המתאגרף היחיד היעיל ביותר.ופי 10 עד 50 מהר יותר מבוקסרים אחרים בשימוש נפוץ57.כדי לבדוק את ההשפעה של מתאמי שפע, תת-מדגם שנבחר באקראי של מטאנומיקה (10 עבור כל אחד משני מערכי הנתונים של Tara Ocean, 10 עבור BioGEOTRACES, 5 עבור כל סדרת זמן ו-5 עבור Malaspina) השתמשו בנוסף בדגימות בלבד.דגימות פנימיות מקובצות כדי לקבל מידע כיסוי.(מידע נוסף).
גנומים נוספים (חיצוניים) נכללו בניתוח שלאחר מכן, כלומר 830 MAG שנבחרו באופן ידני מתת-קבוצה של מערך הנתונים של Tara Oceans26, 5287 SAGs ממערך הנתונים GORG20 ונתונים ממסד הנתונים של MAR (MarDB v. 4) מ-1707 REFs מבודדים ו 682 SAGs) 27. עבור מערך הנתונים של MarDB, גנומים נבחרים על סמך מטא נתונים זמינים אם סוג המדגם תואם לביטוי הרגולרי הבא: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] מבודד'.
האיכות של כל מיכל מטגנומי ושל גנומים חיצוניים הוערכה באמצעות CheckM (v.1.0.13) ו-Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59.אם CheckM או Anvi'o מדווחים על ≥50% שלמות/שלמות ו≤10% זיהום/יתירות, אז שמור תאים מטאנומיים וגנומים חיצוניים לניתוח מאוחר יותר.ציונים אלה שולבו לאחר מכן לשלמות ממוצעת (mcpl) ולזיהום ממוצע (mctn) כדי לסווג את איכות הגנום על פי קריטריונים של הקהילה60 באופן הבא: איכות גבוהה: mcpl ≥ 90% ו-mctn ≤ 5%;איכות טובה: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, איכות בינונית: mcpl ≥ 50% ו-mctn ≤ 10%, איכות הוגנת: mcpl ≤ 90% או mctn ≥ 10%.לאחר מכן, הגנומים המסונננים היו בקורלציה עם ציוני האיכות (Q ו-Q') באופן הבא: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (שונות זנים)/100 + 0.5 x log[N50] .(מיושם ב-dRep61).
כדי לאפשר ניתוח השוואתי בין מקורות נתונים וסוגי גנום שונים (MAG, SAG ו-REF), 34,799 גנומים הופרדו בהתבסס על זהות נוקלאוטידים ממוצעת (ANI) באמצעות dRep (v.2.5.4).חוזר) 61 עם 95% ספי ANI28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) וגנים של סמן בעותק בודד באמצעות SpecI63 המספקים צבירת גנום ברמת המין.גנום מייצג נבחר עבור כל אשכול dRep לפי ציון האיכות המקסימלי (Q') שהוגדר לעיל, שנחשב למייצג של המין.
כדי להעריך את מהירות המיפוי, נעשה שימוש ב-BWA (v.0.7.17-r1188, -a) למיפוי כל 1038 הקבוצות של קריאות מטאנומיות עם 34,799 גנומים הכלולים ב-OMD.קריאות מבוקרות איכות מופו במצב יחיד והיישורים שהתקבלו סוננו כדי לשמור רק על יישורים באורך ≥45 bp.וזהות ≥95%.יחס התצוגה עבור כל דגימה הוא אחוז הקריאות שנותרו לאחר הסינון חלקי המספר הכולל של קריאות בקרת האיכות.באמצעות אותה גישה, כל אחד מ-1038 המטאנומים צומצם ל-5 מיליון הוספות (נתונים מורחבים, איור 1c) והותאם ל-GORG SAG ב-OMD ובכל GEM16.כמות ה-MAGs שהוחזרו ממי ים בקטלוג GEM16 נקבעה על ידי שאילתות מילות מפתח של מקורות מטאנומיים, בחירת דגימות מי ים (למשל, בניגוד למשקעים ימיים).באופן ספציפי, אנו בוחרים "מימי" כ"קטגוריית_מערכת אקולוגית", "ימי" כ"סוג_מערכת אקולוגית", ומסננים "בית גידול" כ"אוקיינוס ​​עמוק", "ימי", "אוקיינוס ​​ימי", "מימי פלגי", "מים ימיים" , "אוקיינוס", "מי ים", "מי ים עיליים", "מי ים עיליים".זה הביא ל-5903 MAGs (734 באיכות גבוהה) שהופצו על פני 1823 OTUs (צפיות כאן).
גנומים פרוקריוטיים סומנו בצורה טקסונומית באמצעות GTDB-Tk (v.1.0.2)64 עם פרמטרי ברירת מחדל המכוונים ל-GTDB r89 גרסה 13. Anvi'o שימש לזיהוי גנומים אוקריוטיים בהתבסס על חיזוי תחום והיזכרות ≥50% ויתירות ≤ 10%.הביאור הטקסונומי של מין מוגדר כאחד מהגנומים המייצגים שלו.למעט איקריוטים (148 MAG), כל גנום סומן לראשונה באופן תפקודי באמצעות פרוקה (v.1.14.5)65, מתן שמות של גנים שלמים, הגדרת פרמטרים של "ארכאאה" או "חיידקים" לפי הצורך, מה שמדווח גם עבור לא- גנים מקודדים.ואזורי CRISPR, בין תכונות גנומיות אחרות.הערה גנים חזויים על ידי זיהוי גנים אוניברסליים של סמן עותק בודד (uscMG) באמצעות fetchMG (v.1.2)66, הקצאת קבוצות אורתולוגיות ושאילתה באמצעות emapper (v.2.0.1)67 בהתבסס על eggNOG (v.5.0)68.מסד הנתונים של KEGG (פורסם ב-10 בפברואר 2020) 69. השלב האחרון בוצע על ידי התאמת חלבונים למסד הנתונים של KEGG באמצעות DIAMOND (v.0.9.30)70 עם שאילתה וכיסוי נושא של ≥70%.התוצאות סוננו עוד יותר על פי צינור הערת גנום פרוקריוטי של NCBI71 בהתבסס על קצב סיביות של ≥ 50% מהקצב המרבי הצפוי (הקישור עצמו).רצפי גנים שימשו גם כקלט לזיהוי BGCs בגנום באמצעות antiSMASH (v.5.1.0)72 עם פרמטרי ברירת מחדל ופיצוצי מקבץ שונים.כל הגנומים והביאורים נאספו לתוך OMD יחד עם מטא נתונים הקשריים הזמינים באינטרנט (https://microbiomics.io/ocean/).
בדומה לשיטות שתוארו קודם לכן12,22 השתמשנו ב-CD-HIT (v.4.8.1) כדי לאסוף למעלה מ-56.6 מיליון גנים מקודדי חלבון מגנום חיידקים וארכיאליים מ-OMD ל-95% זהות וגנים קצרים יותר (90% כיסוי)73 עד >17.7 מיליון צבירי גנים.הרצף הארוך ביותר נבחר כגן המייצג עבור כל צביר גנים.1038 המטאנומים הותאמו לאחר מכן ליותר מ-17.7 מיליון חברי אשכול BWA (-a) וקבצי ה-BAM שהתקבלו סוננו כדי לשמור רק יישורים עם ≥95% אחוז זהות ו≥45 יישור בסיס.שפע הגנים המנורמלים באורך חושב על ידי ספירה תחילה של תוספות מהיישור הייחודי הטוב ביותר ולאחר מכן, עבור תוספות מטושטשות, הוספת ספירות חלקיות לגני המטרה המתאימים באופן פרופורציונלי למספר התוספות הייחודיות שלהם.
הגנומים מה-OMD המורחב (עם MAGs נוספים מ-"Ca. Eudormicrobiaceae", ראה להלן) נוספו למסד הנתונים של כלי הניתוח המטאנומי mOTUs74 (v.2.5.1) כדי ליצור מסד נתונים מורחב של mOTU.רק שישה גנומים בעותק בודד (23,528 גנומים) שרדו מתוך עשרה uscMGs.הרחבת המאגר הביאה ל-4,494 אשכולות נוספים ברמת המין.1038 מטאנומים נותחו באמצעות פרמטרי ברירת מחדל של mOTU (v.2).סך של 989 גנומים הכלולים ב-644 צבירי mOTU (95% REF, 5% SAG ו-99.9% השייכים ל-MarDB) לא זוהו על ידי פרופיל mOTU.זה משקף מקורות נוספים שונים של בידוד ימי של הגנום של MarDB (רוב הגנום הבלתי מזוהים קשורים לאורגניזמים מבודדים ממשקעים, מארחים ימיים וכו').כדי להמשיך להתמקד בסביבת האוקיינוס ​​הפתוח במחקר זה, הסרנו אותם מהניתוח במורד הזרם אלא אם כן הם זוהו או נכללו במסד הנתונים המורחב של mOTU שנוצר במחקר זה.
כל ה-BGCs מ-MAG, SAG ו-REF ב-OMD (ראה לעיל) שולבו עם BGCs שזוהו בכל הפיגומים המטגנומיים (antiSMASH v.5.0, פרמטרי ברירת מחדל) ואופיינו באמצעות BiG-SLICE (v.1.1) (דומיין PFAM )75.בהתבסס על תכונות אלה, חישבנו את כל מרחקי הקוסינוס בין BGCs וקיבוץ אותם (קישורים ממוצעים) ל-GCF ו-GCC באמצעות ספי מרחק של 0.2 ו-0.8 בהתאמה.ספים אלה הם התאמה של ספים ששימשו בעבר באמצעות מרחק אוקלידי75 יחד עם מרחק קוסינוס, מה שמקל על חלק מהשגיאה באסטרטגיית האשכול המקורית של BiG-SLICE (מידע משלים).
לאחר מכן סוננו BGCs כדי לשמור רק ≥5 kb מקודדים על פיגומים כדי להפחית את הסיכון לפרגמנטציה כפי שתואר בעבר16 וכדי לא לכלול REFs ו-SAGs של MarDB שלא נמצאו ב-1038 מטאנומים (ראה לעיל).זה הביא לכך שסה"כ 39,055 BGCs מקודדים על ידי הגנום OMD, עם 14,106 נוספים שזוהו על מקטעים מטאנומיים (כלומר לא משולבים לתוך MAGs).BGCs "מטגנומיים" אלה שימשו להערכת חלקו של פוטנציאל הביוסינתזה של מיקרוביום ימי שלא נלכד במסד הנתונים (מידע משלים).כל BGC אופיינה פונקציונלית על פי סוגי מוצרים חזויים שהוגדרו על ידי אנטי-SMASH או קטגוריות מוצרים גסות יותר שהוגדרו ב-BiG-SCAPE76.כדי למנוע הטיית דגימה בכימות (הרכב טקסונומי ופונקציונלי של GCC/GCF, מרחק של GCF ו-GCC למאגרי מידע, ושפע מטאנומי של GCF), על ידי שמירת רק ה-BGC הארוך ביותר לכל GCF עבור כל מין, 39,055 BGCs בוטלו עוד יותר, וכתוצאה מכך סך של 17,689 BGC.
החידוש של GCC ו-GCF הוערך בהתבסס על המרחק בין מסד הנתונים המחושב (מסד הנתונים RefSeq ב-BiG-FAM)29 לבין ה-BGC המאומת בניסוי (MIBIG 2.0)30.עבור כל אחד מ-17,689 ה-BGC המייצגים, בחרנו את מרחק הקוסינוס הקטן ביותר למסד הנתונים המתאים.המרחקים המינימליים הללו נמדדים לאחר מכן (ממוצע) לפי GCF או GCC, לפי העניין.GCF נחשב לחדש אם המרחק למסד הנתונים גדול מ-0.2, מה שמתאים להפרדה אידיאלית בין ה-GCF (הממוצע) לבין הפניה.עבור GCC, אנו בוחרים ב-0.4, שהוא פי שניים מהסף שהוגדר על ידי GCF, כדי לנעול מערכת יחסים ארוכת טווח עם קישורים.
השפע המטאנומי של BGC הוערך כשפע הממוצע של הגנים הביוסינתטיים שלו (כפי שנקבע על ידי אנטי-SMASH) הזמינים מפרופילים ברמת הגן.השפע המטאנומי של כל GCF או GCC חושב לאחר מכן כסכום של BGCs מייצגים (מתוך 17,689).מפות השפע הללו נורמלו לאחר מכן להרכב הסלולרי באמצעות ספירת ה-mOTU לכל דגימה, שהייתה גם אחראית למאמצי הרצף (נתונים מורחבים, איור 1ד).השכיחות של GCF או GCC חושבה כאחוז הדגימות עם שפע > 0.
המרחק האוקלידי בין דגימות חושב מפרופיל GCF המנורמל.מרחקים אלו הצטמצמו בגודלם באמצעות UMAP77 וההטבעות שנוצרו שימשו לצבירת צפיפות ללא פיקוח באמצעות HDBSCAN78.המספר המינימלי האופטימלי של נקודות לאשכול (ומכאן מספר האשכולות) המשמש את HDBSCAN נקבע על ידי מיקסום ההסתברות המצטברת לחברות באשכול.האשכולות שזוהו (ותת-מדגם מאוזן אקראי של אשכולות אלה כדי להסביר הטיה בניתוח רב-משתני תמורה של שונות (PERMANOVA)) נבדקו עבור מובהקות מול מרחקים אוקלידיים לא מופחתים באמצעות PERMANOVA.גודל הגנום הממוצע של הדגימות חושב על סמך השפע היחסי של mOTU וגודל הגנום המשוער של חברי הגנום.בפרט, גודל הגנום הממוצע של כל mOTU הוערך כממוצע גדלי הגנום של חבריו מתוקן לשלמות (לאחר סינון) (לדוגמה, לגנום שלם של 75% באורך של 3 מגה-ביט יש גודל מותאם של 4 Mb).עבור גנומים בינוניים עם שלמות ≥70%.גודל הגנום הממוצע עבור כל דגימה חושב לאחר מכן כסכום גדלי הגנום של mOTU המשוקלל לפי שפע יחסי.
קבוצה מסוננת של BGCs מקודדים בגנום ב-OMD מוצגת בעצי GTDB חיידקיים וארכיאליים (במסגרות של ≥5 kb, למעט REF ו-SAG MarDB שלא נמצאו ב-1038 מטאנומים, ראה לעיל) וקטגוריות המוצרים החזויות שלהם על סמך הפילוגנטי מיקום הגנום (ראה לעיל).תחילה צמצמנו את הנתונים לפי מינים, תוך שימוש בגנום עם הכי הרבה BGCs במין זה כמייצג.לצורך הדמיה, הנציגים חולקו עוד יותר לקבוצות עצים, ושוב, עבור כל קליד תאי, הגנום המכיל את המספר הגדול ביותר של BGCs נבחר כנציג.מינים מועשרים ב-BGC (לפחות גנום אחד עם יותר מ-15 BGCs) נותחו עוד יותר על ידי חישוב אינדקס הגיוון של שאנון עבור סוגי המוצרים המקודדים באותם BGCs.אם כל סוגי המוצרים החזויים זהים, הכלאיים כימיים ו-BGCs מורכבים אחרים (כפי שחזו על ידי אנטי-SMAH) נחשבים כשייכים לאותו סוג מוצר, ללא קשר לסדר שלהם באשכול (למשל מיזוג חלבון-בקטריוצין וחיידקי-בקטריוצין-פרוטאופרוטאין גוּף).היברידי).
שאר ה-DNA (מוערך ב-6 ננוגרם) מדגימת Malaspina MP1648, התואמת לדגימה הביולוגית SAMN05421555 ומותאמת ל-Illumina SRR3962772 קריאה מטאגנומית לקריאה קצרה, מעובדת לפי פרוטוקול רצף PacBio עם קלט נמוך במיוחד לשימוש ב-Pacbellification gDNA ערכת מדגם PacBio ערכה (100-980-000) וערכת הכנת תבנית SMRTbell Express 2.0 (100-938-900).בקצרה, ה-DNA הנותר נחתך, תוקן וטיהרו (חרוזי ProNex) באמצעות Covaris (g-TUBE, 52104).לאחר מכן עובר DNA מטוהר להכנה של הספרייה, הגברה, טיהור (חרוזי ProNex) ובחירת גודל (>6 קילו-בייטים, Blue Pippin) לפני שלב טיהור סופי (חרוזי ProNex) ורצף על פלטפורמת Sequel II.
שחזור של שני הראשונים כ.עבור MAG Eremiobacterota, זיהינו שישה ANIs נוספים מעל 99% (אלה כלולים באיור 3), אשר סוננו בתחילה על סמך ציוני זיהום (מאוחר יותר זוהו ככפילויות גנים, ראה להלן).מצאנו גם מגש שכותרתו "Ca".Eremiobacterota" ממחקרים שונים23 והשתמש בהם יחד עם שמונה MAGs מהמחקר שלנו כאסמכתא לקריאה מטאנומית מ-633 דגימות מועשרות באוקריוטים (>0.8 מיקרומטר) באמצעות BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, - דגל) לדגימה מופחתת. מיפוי (5 מיליון קריאות).בהתבסס על מפות ספציפיות להעשרה (מסוננות לפי 95% זהות יישור ו-80% כיסוי קריאה), נבחרו 10 מטאנומים (כיסוי צפוי ≥5×) להרכבה ו-49 מטאנומים נוספים (כיסוי צפוי ≥1×) עבור מתאם תוכן.באמצעות אותם פרמטרים כמו לעיל, דגימות אלה הוכנסו ונוספו 10 Ca's נוספים.MAG Eremiobacterota שוחזר.16 MAGs אלה (לא סופרים את השניים שכבר נמצאים במסד הנתונים) מביאים את המספר הכולל של גנומים ב-OMD המורחב ל-34,815.ל-MAGs מוקצות דרגות טקסונומיות על סמך הדמיון הגנומי והמיקום שלהם ב-GTDB.18 MAGs חולקו באמצעות dRep ל-5 מינים (ANI תוך ספציפי >99%) ו-3 סוגים (ANI תוך-גנרי 85% עד 94%) באותה משפחה79.נציגי המינים נבחרו באופן ידני על סמך שלמות, זיהום ו-N50.המינוח המוצע מסופק במידע המשלים.
הערכת שלמות וזיהום של 'Ca.MAG Eremiobacterota, הערכנו את הנוכחות של uscMG, כמו גם מערכי גנים של סמנים בודדים של שושלת ותחום ספציפיים בשימוש על ידי CheckM ו-Anvi'o.הזיהוי של 2 כפילויות מתוך 40 uscMGs אושר על ידי שחזור פילוגנטי (ראה להלן) כדי לשלול כל זיהום פוטנציאלי (זה מתאים ל-5% על סמך 40 גנים אלה של סמן).מחקר נוסף של חמישה MAG מייצגים 'Ca.הרמה הנמוכה של מזהמים בגנומים המשוחזרים הללו אושרה עבור מיני Eremiobacterota באמצעות ממשק Anvi'o האינטראקטיבי המבוסס על מתאמי שפע והרכב רצף (מידע משלים)59.
לניתוח פילוגנומי, בחרנו חמישה MAG מייצגים "Ca".Eudormicrobiaceae", כל המינים "Ca.הגנום של Eremiobacterota וחברים של phyla אחרים (כולל UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria ו-Planctomycetota) זמין מ-GTDB (r89)13.כל הגנומים הללו סומנו כפי שתואר קודם לכן עבור מיצוי גן של סמן עותק בודד וביאור BGC.הגנום של GTDB נשמר בהתאם לקריטריונים של שלמות וזיהום לעיל.ניתוח פילוגנטי בוצע באמצעות זרימת העבודה של Anvi'o Phylogenetics59.העץ נבנה באמצעות IQTREE (v.2.0.3) (אפשרויות ברירת מחדל ו-bb 1000)80 על יישור של 39 חלבונים ריבוזומליים טנדם שזוהו על ידי Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81.עמדותיו צומצמו.כדי לכסות לפחות 50% מהגנום82 ו-Planctomycecota שימש כקבוצה חיצונית המבוססת על טופולוגיית העץ GTDB.עץ אחד של 40 uscMGs נבנה באמצעות אותם כלים ופרמטרים.
השתמשנו ב-Traitar (v.1.1.2) עם פרמטרי ברירת מחדל (פנוטיפ, מנוקלאוטידים)83 כדי לחזות תכונות מיקרוביאליות נפוצות.חקרנו אורח חיים טורף פוטנציאלי המבוסס על אינדקס טורף שפותח בעבר 84 התלוי בתכולת הגן המקודד חלבון בגנום.באופן ספציפי, אנו משתמשים ב-DIAMOND כדי להשוות חלבונים בגנום מול מסד הנתונים של OrthoMCL (v.4)85 באמצעות האפשרויות –יותר-רגישות –id 25 –query-cover 70 –subject-cover 70 –top 20 ולספור את הגנים המתאימים ל- גני הסמן לטורפים וללא טורפים.המדד הוא ההפרש בין מספר הסימנים הטורפים והלא טורפים.כבקרה נוספת, ניתחנו גם את הגנום "Ca".גורם Entotheonella TSY118 מבוסס על הקשר שלו עם Ca.Eudoremicrobium (גודל גנום גדול ופוטנציאל ביוסינתטי).לאחר מכן, בדקנו קשרים פוטנציאליים בין גנים של סמן טורף ולא טורף לבין הפוטנציאל הביוסינתטי של Ca.Eudormicrobiaceae" ומצא שלא יותר מגן אחד (מכל סוג של גן סמן, כלומר גן טורף/לא טורף) חופף ל-BGC, מה שמצביע על כך ש-BGC אינו מבלבל את אותות הטורף.ביאור גנומי נוסף של רפליקונים מקושקשים בוצע באמצעות TXSSCAN (v.1.0.2) כדי לבחון ספציפית את מערכת ההפרשה, pili ו- flagella86.
חמישה Ca's מייצגים מופו על ידי מיפוי 623 metatranscriptome מחלקי ההעשרה הפרוקריוטים והאוקריוטיים של האוקיינוסים Tara22,40,87 (באמצעות BWA, v.0.7.17-r1188, -a flag).גנום Eudormicrobiaceae.קובצי BAM עובדו עם FeatureCounts (v.2.0.1)88 לאחר כיסוי קריאה של 80% ו-95% סינון זהויות (עם אפשרויות featureCounts -primary -O -fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) סופר את מספר תוספות לכל גן.המפות שנוצרו נורמלו עבור אורך גן ושפע גן סמן mOTU (ספירת החדרה ממוצעת מנורמלת עבור גנים עם ספירת החדרה >0) ועברו טרנספורמציה בלוג ל-22.74 כדי לקבל את הביטוי היחסי לכל תא של כל רמת גן, מה שמסביר גם את שונות ממדגם לדגימה במהלך הרצף.יחסים כאלה מאפשרים ניתוח השוואתי, מפחית בעיות הרכב בעת שימוש בנתוני שפע יחסי.רק דגימות עם יותר מ-5 מתוך 10 הגנים של סמן mOTU נשקלו לניתוח נוסף כדי לאפשר זיהוי של חלק גדול מספיק מהגנום.
פרופיל התעתיק המנורמל של 'Ca.E. taraoceanii היה נתון להפחתת מימדים באמצעות UMAP והייצוג שנוצר שימש לצבירות ללא פיקוח באמצעות HDBSCAN (ראה לעיל) כדי לקבוע את מצב הביטוי.PERMANOVA בודק את המשמעות של ההבדלים בין אשכולות שזוהו במרחב המרחק המקורי (לא מצומצם).ביטוי דיפרנציאלי בין מצבים אלו נבדק על פני הגנום (ראה לעיל) ו-201 מסלולי KEGG זוהו ב-6 קבוצות פונקציונליות, דהיינו: BGC, מערכת הפרשה וגנים דגלים מ-TXSSCAN, אנזימי פירוק (פרוטאז ופפטאזות), וטורפים ולא- גנים טורפים.סמני אינדקס טורפים.עבור כל דגימה, חישבנו את הביטוי המנורמל החציוני עבור כל מחלקה (שים לב שביטוי BGC עצמו מחושב כביטוי החציוני של גנים ביו-סינתטיים עבור אותו BGC) ונבדק עבור מובהקות בין מצבים (בדיקת Kruskal-Wallis מותאמת ל-FDR).
גנים סינתטיים נרכשו מ-GenScript ו-PCR primers נרכשו מ-Microsynth.Phusion polymerase מבית Thermo Fisher Scientific שימש להגברת DNA.פלסמידים NucleoSpin, NucleoSpin ג'ל וערכת טיהור PCR מ-Macherey-Nagel שימשו לטיהור DNA.אנזימי הגבלה ו-T4 DNA ligase נרכשו מ-New England Biolabs.כימיקלים מלבד isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Biosynth) ו-1,4-dithiothreitol (DTT, AppliChem) נרכשו מ-Sigma-Aldrich והשתמשו בהם ללא טיהור נוסף.האנטיביוטיקה chloramphenicol (Cm), spectinomycin dihydrochloride (Sm), ampicillin (Amp), gentamicin (Gt) ו-carbenicillin (Cbn) נרכשו מ-AppliChem.רכיבי מדיה של Bacto Tryptone ו-Bacto Yeast Extract נרכשו מ-BD Biosciences.טריפסין לרצף נרכש מחברת פרומגה.
רצפי גנים חולצו מ-BGC 75.1 החזוי נגד SMASH.E. malaspinii (מידע משלים).
הגנים embA (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4), ו-embAM (כולל בין-גנים באזורים סינתטיים) עם רצף ו- optimum 5. מיועד לביטוי ב-E מתי.הגן embA שוכפל לתוך אתר השיבוט המרובה הראשון (MCS1) של pACYCDuet-1(CmR) ו-pCDFDuet-1(SmR) עם אתרי ביקוע BamHI ו-HindIII.הגנים embM ו-embMopt (מותאמים לקודון) שוכפלו לתוך MCS1 pCDFDuet-1(SmR) עם BamHI ו-HindIII והונחו באתר השיבוט המרובה השני של pCDFDuet-1(SmR) ו-pRSFDuet-1(KanR) (MCS2) עם NdeI/ChoI.קלטת embAM עברה תת-שיבוט לתוך pCDFDuet1(SmR) עם אתרי ביקוע BamHI ו-HindIII.הגן orf3/embI (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) נבנה על ידי PCR של הארכת חפיפה תוך שימוש בפריימרים EmbI_OE_F_NdeI ו-EmbI_OE_R_XhoI, מעוכלים עם NdeI/XhoI, ונקשרים באנזימים מוגבלים (-1-pS-EFD) עם אותו אנזים (-1-pS-EFD) משלים שולחן).6).עיכול וקשירת אנזימי הגבלה בוצעו לפי פרוטוקול היצרן (New England Biolabs).