תודה שביקרת ב-Nature.com.אתה משתמש בגרסת דפדפן עם תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בנוסף, כדי להבטיח תמיכה שוטפת, אנו מציגים את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
סליידרים המציגים שלושה מאמרים בכל שקופית.השתמש בלחצנים 'הקודם' וה'הבא' כדי לעבור בין השקופיות, או בלחצני בקר השקופיות שבקצה כדי לעבור בין כל שקופית.

317 ספקי צינורות סליל נירוסטה

טבלת הרכב כימי מחומר נירוסטה

SPACA6 הוא חלבון משטח המבוטא בזרע שהוא קריטי להיתוך גמטות במהלך רבייה מינית של יונקים.למרות התפקיד הבסיסי הזה, הפונקציה הספציפית של SPACA6 אינה מובנת בצורה גרועה.אנו מבהירים את המבנה הגבישי של התחום החוץ-תאי של SPACA6 ברזולוציה של 2.2 Å, חושפים חלבון דו-תחום המורכב מצרור בעל ארבעה גדילים וסנדוויצ'ים דמויי Ig המחוברים על ידי קישורים גמישים לעין.מבנה זה דומה ל-IZUMO1, חלבון נוסף הקשור להיתוך גמטות, מה שהופך את SPACA6 ו-IZUMO1 לחברים המייסדים במשפחת העל של חלבונים הקשורים להפריה המכונה כאן משפחת העל IST.משפחת העל IST מוגדרת מבנית על ידי צרור ארבעת הסליל המעוות שלה וזוג מוטיבים CXXC מקושרים דיסולפידים.חיפוש מבוסס מבנה AlphaFold של הפרוטאום האנושי זיהה חברי חלבון נוספים ממשפחת העל הזו;במיוחד, רבים מהחלבונים הללו מעורבים בהיתוך גמטות.מבנה SPACA6 והקשר שלו לחברים אחרים במשפחת העל IST מספקים את החוליה החסרה בידע שלנו על היתוך גמטות יונקים.
כל חיי אדם מתחילים בשתי גמטות הפלואידיות נפרדות: הזרע של האב והביצית של האם.זרע זה הוא המנצח בתהליך בחירה אינטנסיבי שבמהלכו מיליוני תאי זרע עוברים דרך מערכת איברי המין הנשית, מתגברים על מכשולים שונים1 ועוברים קיבול, מה שמשפר את תנועתיותם ואת תהליך מרכיבי השטח2,3,4.גם אם הזרע והביצית מוצאים זה את זה, התהליך עדיין לא הסתיים.הביצית מוקפת בשכבה של תאי קומולוס ובמחסום גליקופרוטאין הנקרא zona pellucida, שדרכו צריך לעבור הזרע כדי להיכנס לביצית.זרעונים משתמשים בשילוב של מולקולות הידבקות פני השטח ואנזימים הקשורים לממברנה ומופרשים כדי להתגבר על המחסומים הסופיים הללו5.מולקולות ואנזימים אלו מאוחסנים בעיקר בממברנה הפנימית ובמטריקס האקרוזומלי ומתגלים כאשר הממברנה החיצונית של הזרע עוברת ליזה במהלך התגובה האקרוזומלית6.השלב האחרון במסע האינטנסיבי הזה הוא אירוע איחוי זרע-ביצית, שבו שני התאים מתמזגים את הממברנות שלהם כדי להפוך לאורגניזם דיפלואידי יחיד7.למרות שתהליך זה הוא פורץ דרך ברבייה האנושית, האינטראקציות המולקולריות ההכרחיות אינן מובנות בצורה גרועה.
בנוסף להפריה של גמטות, הכימיה של היתוך של שתי שכבות שומנים בדם נחקרה רבות.באופן כללי, היתוך ממברנה הוא תהליך לא חיובי מבחינה אנרגטית הדורש מזרז חלבון לעבור שינוי קונפורמציה מבני המקרב שני ממברנות זה לזה, שובר את המשכיותן וגורם לאיחוי8,9.זרזי חלבון אלו ידועים בתור fusogens ונמצאו באינספור מערכות היתוך.הם נדרשים לכניסה נגיפית לתאי מארח (למשל, gp160 ב-HIV-1, עלייה בנגיפים, המגלוטינין בנגיפי שפעת) 10,11,12 שליה (סינסיטין)13,14,15 ואיחוזים יוצרי גמטים באאוקריוטים תחתונים ( HAP2/GCS1 בצמחים, פרוטיסטים ופרוקי רגליים) 16,17,18,19.עדיין לא התגלו פוסוגנים לגמטות אנושיות, אם כי מספר חלבונים הוכחו כקריטיים להתקשרות והיתוך גמטות.ה-CD9 שבא לידי ביטוי ביציות, חלבון טרנסממברני הנדרש לאיחוי של גמטות עכברים ואדם, היה הראשון שהתגלה 21,22,23.למרות שהפונקציה המדויקת שלו נותרה לא ברורה, תפקיד בהידבקות, מבנה מוקדי ההידבקות על מיקרוווילי ביצה ו/או לוקליזציה נכונה של חלבוני פני הביצית נראה סביר 24,25,26.שני החלבונים האופייניים ביותר שהם קריטיים לאיחוי גמטים הם חלבון הזרע IZUMO127 וחלבון הביצית JUNO28, והקשר ההדדי ביניהם הוא שלב חשוב בזיהוי הגמטה והיצמדות לפני היתוך.עכברי נוקאאוט זכרים של Izumo1 ועכברי נוקאאוט ג'ונו נקבות הם סטריליים לחלוטין, בדגמים אלו זרע נכנס לחלל הפריוויטליני אך הגמטות לא מתמזגות.באופן דומה, המפגש הופחת כאשר גמטות טופלו בנוגדנים אנטי-IZUMO1 או JUNO27,29 בניסויים בהפריה חוץ גופית אנושית.
לאחרונה התגלתה קבוצה חדשה שהתגלתה של חלבונים המבוטאים בזרע הדומים באופן פנוטיפי ל-IZUMO1 ו-JUNO20,30,31,32,33,34,35.חלבון 6 (SPACA6) הקשור לממברנה אקרוזומלית של זרע זוהה כחיוני להפריה במחקר בקנה מידה גדול של מוטגנזה של עכברים.החדרת הטרנסגן לגן Spaca6 מייצרת זרעונים בלתי ניתנים להיתוך, למרות שהזרעונים הללו חודרים לחלל הפריוויטליני 36 .מחקרי נוק-אאוט שלאחר מכן בעכברים אישרו ש-Spaca6 נדרש להיתוך גמטות 30,32.SPACA6 מתבטא כמעט אך ורק באשכים ויש לו דפוס לוקליזציה דומה לזה של IZUMO1, כלומר בתוך אינטימה של הזרע לפני התגובה האקרוזומלית, ולאחר מכן נודד לאזור המשווה לאחר התגובה האקרוזומלית 30,32.הומולוגיות Spaca6 קיימים במגוון יונקים ואיקריוטים אחרים 30 וחשיבותו לאיחוי גמטות אנושי הוכחה על ידי עיכוב של הפריה אנושית במבחנה על ידי עמידות ל- SPACA6 30.שלא כמו IZUMO1 ו-JUNO, הפרטים של המבנה, האינטראקציות והתפקוד של SPACA6 נותרו לא ברורים.
כדי להבין טוב יותר את התהליך הבסיסי העומד בבסיס ההיתוך של זרע וביצית אנושיים, שיאפשר לנו להודיע ​​על התפתחויות עתידיות בתכנון המשפחה ובטיפולי פוריות, ערכנו מחקרים מבניים וביוכימיים SPACA6.המבנה הגבישי של התחום החוץ-תאי של SPACA6 מראה צרור סליל של ארבעה (4HB) ותחום דמוי אימונוגלובולינים (דמוי Ig) המחוברים על ידי אזורים כמעט גמישים.כפי שנחזה במחקרים קודמים, 7,32,37 מבנה התחום של SPACA6 דומה לזה של IZUMO1 האנושי, ושני החלבונים חולקים מוטיב יוצא דופן: 4HB עם משטח סלילי משולש וזוג מוטיבים של CXXC מקושרים דיסולפידים.אנו מציעים כי IZUMO1 ו- SPACA6 מגדירים כעת משפחת-על גדולה יותר הקשורה מבחינה מבנית של חלבונים הקשורים לאיחוי גמטה.תוך שימוש בתכונות ייחודיות למשפחת העל, ערכנו חיפוש ממצה אחר הפרוטום האנושי המבני AlphaFold, תוך זיהוי חברים נוספים ממשפחת העל הזו, כולל מספר חברים המעורבים בהיתוך גמטות ו/או הפריה.כעת נראה שיש קפל מבני ומשפחת-על משותפים של חלבונים הקשורים להיתוך גמטות, והמבנה שלנו מספק מפה מולקולרית של היבט חשוב זה של מנגנון היתוך הגמטות האנושי.
SPACA6 הוא חלבון חוצה ממברנה במעבר חד עם גליקן אחד מקושר N ושישה קשרים דיסולפידים משוערים (איורים S1a ו-S2).ביטאנו את התחום החוץ-תאי של SPACA6 אנושי (שאריות 27-246) בתאי Drosophila S2 וטיהרנו את החלבון באמצעות זיקה לניקל, חילופי קטונים וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (איור S1b).האקטודומיין SPACA6 המטוהר מאוד יציב והומוגני.ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל בשילוב עם פיזור אור מצולע (SEC-MALS) גילה שיא אחד עם משקל מולקולרי מחושב של 26.2 ± 0.5 kDa (איור S1c).זה תואם את גודל האקטודומיין המונומרי SPACA6, מה שמעיד על כך שאוליגומריזציה לא התרחשה במהלך הטיהור.בנוסף, ספקטרוסקופיה של דיכרואיזם מעגלי (CD) חשפה מבנה α/β מעורב עם נקודת התכה של 51.3 מעלות צלזיוס (איור S1d,e).דה-קונבולוציה של ספקטרום ה-CD גילה 38.6% אלמנטים α-סלילי ו-15.8% β-גדילי (איור S1d).
האקטודומיין SPACA6 התגבש באמצעות זריעת מטריצה ​​אקראית38 וכתוצאה מכך ערכת נתונים ברזולוציה של 2.2 Å (טבלה 1 ואיור S3).תוך שימוש בשילוב של החלפה מולקולרית מבוססת קטעים ונתוני שלב SAD עם חשיפת ברומיד לקביעת מבנה (טבלה 1 ואיור S4), המודל המעודן הסופי מורכב משאריות 27-246.בזמן קביעת המבנה, לא היו מבנים ניסויים או AlphaFold זמינים.גודל האקטודומיין SPACA6 הוא 20 Å × 20 Å × 85 Å, מורכב משבעה סלילים ותשעה גדילי β, ויש לו קפל שלישוני מוארך מיוצב על ידי שישה קשרים דיסולפידים (איור 1a, ב).צפיפות האלקטרונים החלשה בקצה השרשרת הצדדית של Asn243 מצביעה על כך ששריד זה הוא גליקוזילציה מקושרת N.המבנה מורכב משני תחומים: צרור N-טרמינלי ארבעה סליל (4HB) ותחום דמוי Ig מסוף C עם אזור ציר ביניים ביניהם (איור 1c).
מבנה של התחום החוץ-תאי של SPACA6.דיאגרמת רצועה של התחום החוץ-תאי של SPACA6, צבע השרשרת מ-N עד C-terminus מכחול כהה לאדום כהה.ציסטינים המעורבים בקשרים דיסולפידים מודגשים במגנטה.ב טופולוגיה של התחום החוץ-תאי של SPACA6.השתמש באותה ערכת צבעים כמו באיור 1a.c SPACA6 תחום חוץ תאי.תרשימי רצועות התחום 4HB, ציר ו-Ig בצבע כתום, ירוק וכחול, בהתאמה.השכבות אינן מצוירות בקנה מידה.
תחום 4HB של SPACA6 כולל ארבעה סלילים עיקריים (סלילים 1-4), המסודרים בצורה של סליל סליל (איור 2a), המתחלפים בין אינטראקציות אנטי-מקבילות ומקבילות (איור 2b).סליל נוסף קטן עם סיבוב יחיד (סליל 1′) מונח בניצב לצרור, ויוצר משולש עם סלילים 1 ו-2. משולש זה מעוות מעט באריזה המפותלת של האריזה הצפופה יחסית של סלילים 3 ו-4 ( איור 2א).
תרשים רצועות 4HB N-terminal.ב מבט מלמעלה של צרור של ארבעה סלילים, כל סליל מודגש בכחול כהה בקצה ה-N ואדום כהה בקצה ה-C.ג דיאגרמת גלגל ספירלה מלמעלה למטה עבור 4HB, כאשר כל שארית מוצגת כעיגול המסומן בקוד חומצת אמינו של אות אחת;רק ארבע חומצות האמינו בחלק העליון של הגלגל ממוספרות.שאריות לא קוטביות נצבעות בצהוב, שאריות לא טעונות קוטביות נצבעות בירוק, שאריות טעונות חיוביות נצבעות בכחול, ושאריות טעונות שלילי נצבעות באדום.ד פנים משולשות של תחום 4HB, עם 4HBs בכתום וצירים בירוק.שני התוספות מציגות קשרי דיסולפיד בצורת מוט.
4HB מרוכז על ליבה הידרופוביה פנימית המורכבת בעיקר משאריות אליפטיות וארומטיות (איור 2c).הליבה מכילה קשר דיסולפידי בין Cys41 ל-Cys55 המקשר בין סלילים 1 ו-2 במשולש מוגבה עליון (איור 2d).שני קשרי דיסולפיד נוספים נוצרו בין מוטיב CXXC ב- Helix 1' ומוטיב CXXC נוסף שנמצא בקצה סיכת ה-β באזור הציר (איור 2d).שייר ארגינין שמרני עם פונקציה לא ידועה (Arg37) ממוקם בתוך משולש חלול שנוצר על ידי סלילים 1', 1 ו-2. אטומי פחמן אליפטיים Cβ, Cγ ו-Cδ Arg37 מקיימים אינטראקציה עם הליבה ההידרופוביה, וקבוצות הגואנידין שלה נעות באופן מחזורי. בין סלילים 1′ ו-1 באמצעות אינטראקציות בין עמוד השדרה Thr32 ושרשרת הצד (איור S5a,b).Tyr34 משתרע לתוך החלל ומשאיר שני חללים קטנים שדרכם Arg37 יכול לקיים אינטראקציה עם הממס.
תחומי β-סנדוויץ' דמויי Ig הם משפחת-על גדולה של חלבונים החולקים את התכונה המשותפת של שני גליונות β אמפיפטיים מרובי גדילים המקיימים אינטראקציה באמצעות ליבה הידרופוביה 39. לתחום ה-Ig דמוי ה-C-טרמינלי של SPACA6 יש את אותה תבנית ומורכב משתי שכבות (איור S6a).גיליון 1 הוא יריעת β של ארבעה גדילים (גדילים D, F, H ו-I) כאשר הגדילים F, H ו-I יוצרים סידור אנטי מקביל, והגדילים I ו-D מקבלים אינטראקציה מקבילה.טבלה 2 היא גיליון בטא דו-גדילי קטן אנטי-מקבילי (גדילים E ו-G).קשר דיסולפיד פנימי נצפה בין קצה ה-C של שרשרת ה-E למרכז שרשרת ה-H (Cys170-Cys226) (איור S6b).קשר דיסולפיד זה מקביל לקשר הדיסולפיד בתחום ה-β-סנדוויץ' של אימונוגלובולין40,41.
יריעת β ארבעת הגדילים מתפתלת לכל אורכה, ויוצרות קצוות א-סימטריים הנבדלים בצורתם ובאלקטרוסטטיקה.הקצה הדק יותר הוא משטח סביבתי הידרופובי שטוח הבולט בהשוואה למשטחים הלא אחידים והמגוונים הנותרים ב-SPACA6 (איור S6b,c).הילה של קבוצות קרבוניל/אמינו עמוד השדרה חשופות ושרשראות צד קוטביות מקיפה את פני השטח ההידרופוביים (איור S6c).השוליים הרחבים יותר מכוסים על ידי מקטע סליל מכוסה החוסם את החלק ה-N-טרמינלי של הליבה ההידרופוביה ויוצר שלושה קשרי מימן עם הקבוצה הקוטבית הפתוחה של עמוד השדרה של שרשרת F (איור S6d).החלק C-טרמינל של קצה זה יוצר כיס גדול עם ליבה הידרופובית חשופה חלקית.הכיס מוקף במטענים חיוביים עקב שלוש קבוצות של שאריות ארגינין כפולות (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ו-Arg212-Arg214) והיסטידין מרכזי (His220) (איור S6e).
אזור הציר הוא קטע קצר בין התחום הסליל לתחום דמוי ה-Ig, המורכב משכבת ​​β תלת גדילית אנטי-מקבילית אחת (גדילים A, B ו-C), סליל קטן של 310 וכמה מקטעים סליליים אקראיים ארוכים.(איור S7).נראה שרשת של מגעים קוולנטיים ואלקטרוסטטיים באזור הציר מייצבת את הכיוון בין 4HB לתחום דמוי Ig.ניתן לחלק את הרשת לשלושה חלקים.החלק הראשון כולל שני מוטיבים של CXXC (27CXXC30 ו-139CXXC142) היוצרים זוג קשרים דיסולפידיים בין סיכת ה-β בציר לבין סליל 1' ב-4HB.החלק השני כולל אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין התחום דמוי ה-Ig והציר.Glu132 בציר יוצר גשר מלח עם Arg233 בתחום דמוי Ig ו- Arg135 בציר.החלק השלישי כולל קשר קוולנטי בין התחום דמוי ה-Ig לאזור הציר.שני קשרים דיסולפידיים (Cys124-Cys147 ו-Cys128-Cys153) מחברים את לולאת הציר למקשר מיוצב על ידי אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין Gln131 לקבוצה התפקודית של עמוד השדרה, מה שמאפשר גישה לתחום דמוי Ig הראשון.שַׁרשֶׁרֶת.
המבנה של האקטודומיין SPACA6 ומבנים בודדים של תחומים דמויי 4HB ו-Ig שימשו לחיפוש רשומות דומות מבחינה מבנית במאגרי חלבונים 42 .זיהינו התאמות עם ציוני Dali Z גבוהים, סטיות תקן קטנות וציוני LALI גדולים (האחרון הוא מספר השיירים המקבילים מבחינה מבנית).בעוד של-10 ההתאמות הראשונות מחיפוש ה-ectodomin המלא (טבלה S1) היה ציון Z מקובל של >842, חיפוש אחר תחום 4HB או Ig-like לבדו הראה שרוב ההתאמות הללו תואמות לסנדוויצ'ים β בלבד.קפל בכל מקום שנמצא בחלבונים רבים.כל שלושת החיפושים בדאלי החזירו רק תוצאה אחת: IZUMO1.
זה זמן רב הוצע כי SPACA6 ו-IZUMO1 חולקים קווי דמיון מבניים7,32,37.למרות שדומיין האקטודומיינים של שני החלבונים הקשורים להיתוך גמטות אלה חולקים רק 21% זהות רצף (איור S8a), עדויות מורכבות, כולל דפוס קשר דיסולפיד שמור ותחום C-terminal דמוי Ig חזוי ב-SPACA6, אפשרו ניסיונות מוקדמים לבנות מודל הומולוגיה של עכבר SPACA6 באמצעות IZUMO1 כתבנית37.המבנה שלנו מאשר את התחזיות הללו ומראה את מידת הדמיון האמיתית.למעשה, המבנים SPACA6 ו-IZUMO137,43,44 חולקים את אותה ארכיטקטורה של שני תחומים (איור S8b) עם תחומי β-סנדוויץ' דומים של 4HB ו-Ig המחוברים על ידי אזור ציר (איור S8c).
ל-IZUMO1 ול-SPACA6 4HB יש הבדלים משותפים מצרורות ספירלה קונבנציונליים.4HBs טיפוסיים, כמו אלה שנמצאו במתחמי חלבון SNARE המעורבים בהיתוך אנדוזומלי 45,46, בעלי סלילים מרווחים באופן שווה השומרים על עקמומיות קבועה סביב ציר מרכזי 47. לעומת זאת, התחומים הסליליים ב-IZUMO1 וגם ב-SPACA6 היו מעוותים, עם עקמומיות משתנה ו אריזה לא אחידה (איור S8d).הפיתול, שנגרם כנראה מהמשולש שנוצר על ידי סלילים 1′, 1 ו-2, נשמר ב-IZUMO1 וב-SPACA6 ומיוצב על ידי אותו מוטיב CXXC על סליל 1'.עם זאת, הקשר הדיסולפידי הנוסף שנמצא ב-SPACA6 (Cys41 ו-Cys55 המקשרים קוולנטיות את הסלילים 1 ו-2 לעיל) יוצר קודקוד חד יותר בקודקוד המשולש, מה שהופך את SPACA6 למפותל יותר מ-IZUMO1, עם משולשי חלל בולטים יותר.בנוסף, ל- IZUMO1 חסר Arg37 שנצפה במרכז חלל זה ב- SPACA6.לעומת זאת, ל-IZUMO1 יש גרעין הידרופובי טיפוסי יותר של שאריות אליפטיות וארומטיות.
ל-IZUMO1 יש תחום דמוי Ig המורכב מגיליון β דו גדילי וחמישה גדילים43.הגדיל הנוסף ב- IZUMO1 מחליף את הסליל ב- SPACA6, המקיים אינטראקציה עם גדיל F כדי להגביל את קשרי המימן בעמוד השדרה בגדיל.נקודת השוואה מעניינת היא מטען פני השטח החזוי של התחומים דמויי ה-Ig של שני החלבונים.משטח IZUMO1 טעון שלילי יותר ממשטח SPACA6.מטען נוסף ממוקם בסמוך לקצה ה-C הפונה לממברנת הזרע.ב- SPACA6, אותם אזורים היו יותר ניטרליים או בעלי מטען חיובי (איור S8e).לדוגמה, המשטח ההידרופובי (קצוות דקים יותר) ובורות טעונים חיובית (קצוות רחבים יותר) ב- SPACA6 טעונים שלילי ב- IZUMO1.
למרות שהקשר ומרכיבי המבנה המשני בין IZUMO1 ו- SPACA6 נשמרים היטב, היישור המבני של התחומים דמויי ה-Ig הראה ששני התחומים נבדלים בכיוון הכללי שלהם זה ביחס לזה (איור S9).צרור הספירלה של IZUMO1 מעוקל סביב ה-β-סנדוויץ', ויוצר את צורת ה"בומרנג" שתוארה קודם לכן במרחק של כ-50 מעלות מהציר המרכזי.לעומת זאת, האלומה הסלילנית ב- SPACA6 הוטה בערך 10° בכיוון ההפוך.ההבדלים בכיוונים אלה נובעים ככל הנראה מהבדלים באזור הציר.ברמת הרצף הראשוני, IZUMO1 ו- SPACA6 חולקים דמיון קטן ברצף בציר, למעט שיירי ציסטאין, גליצין וחומצה אספרטית.כתוצאה מכך, קשרי מימן ורשתות אלקטרוסטטיות שונות לחלוטין.רכיבי מבנה משני של גיליון β משותפים ל-IZUMO1 ול-SPACA6, אם כי השרשראות ב-IZUMO1 ארוכות הרבה יותר והסליל 310 (סליל 5) ייחודי ל-SPACA6.הבדלים אלה מביאים לכיווני תחום שונים עבור שני חלבונים דומים אחרת.
חיפוש שרת ה-Dali שלנו גילה ש- SPACA6 ו- IZUMO1 הם שני המבנים היחידים שנקבעו בניסוי המאוחסנים במסד הנתונים של החלבונים שיש להם את הקפל הספציפי הזה של 4HB (טבלה S1).לאחרונה, DeepMind (Alphabet/Google) פיתחה את AlphaFold, מערכת מבוססת רשת עצבית שיכולה לחזות במדויק את המבנים התלת-ממדיים של חלבונים מרצפים ראשוניים48.זמן קצר לאחר שפתרנו את מבנה SPACA6, שוחרר מסד הנתונים של AlphaFold, המספק מודלים של מבנה חזוי המכסים 98.5% מכלל החלבונים בפרוטאום האנושי48,49.באמצעות מבנה SPACA6 שנפתר כמודל חיפוש, חיפוש הומולוגיה מבנית של המודל בפרוטאום האנושי AlphaFold זיהה מועמדים בעלי קווי דמיון מבניים אפשריים ל- SPACA6 ו- IZUMO1.בהתחשב בדיוק המדהים של AlphaFold בחיזוי SPACA6 (איור S10a) - במיוחד תחום האקטודומיין של 1.1 Å rms בהשוואה למבנה הפתיר שלנו (איור S10b) - אנו יכולים להיות בטוחים שההתאמות המזוהות של SPACA6 צפויות להיות מדויקות.
בעבר, PSI-BLAST חיפש את אשכול IZUMO1 עם שלושה חלבונים אחרים הקשורים לזרע: IZUMO2, IZUMO3 ו-IZUMO450.AlphaFold חזה שחלבונים אלה ממשפחת IZUMO מתקפלים לתוך תחום 4HB עם אותו דפוס קשר דיסולפידי כמו IZUMO1 (איורים 3a ו-S11), אם כי חסר להם תחום דמוי Ig.ההשערה היא ש-IZUMO2 ו-IZUMO3 הם חלבוני ממברנה חד-צדדיים הדומים ל-IZUMO1, בעוד ש-IZUMO4 נראה מופרש.הפונקציות של חלבוני IZUMO 2, 3 ו-4 בהיתוך גמטות לא נקבעו.ידוע ש-IZUMO3 ממלא תפקיד בביוגנזה של אקרוזום במהלך התפתחות spermatozoa51, וחלבון IZUMO יוצר קומפלקס50.שימור חלבוני IZUMO ביונקים, זוחלים ודו-חיים מצביע על כך שתפקודם הפוטנציאלי עולה בקנה אחד עם זה של חלבונים ידועים אחרים הקשורים להיתוך גמטות, כגון DCST1/2, SOF1 ו-FIMP.
תרשים של ארכיטקטורת התחום של משפחת העל IST, עם 4HB, ציר ותחומים דמויי Ig מודגשים בכתום, ירוק וכחול, בהתאמה.ל-IZUMO4 אזור C-terminal ייחודי שנראה שחור.קשרי דיסולפיד המאושרים והמשוערים מוצגים על ידי קווים מוצקים ומקווקוים, בהתאמה.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F95) (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) מוצגים באותו טווח צבעים כמו לוח A. קשרי דיסולפיד מוצגים במגנטה.סלילי TMEM95, IZUMO2 ו-IZUMO3 אינם מוצגים.
בניגוד לחלבון IZUMO, חלבוני SPACA אחרים (כלומר, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 ו- SPACA9) נחשבים שונים מבחינה מבנית מ-SPACA6 (איור S12).רק ל-SPACA9 יש 4HB, אך לא צפוי להיות אותו כיוון מקביל-אנטי-מקביל או אותו קשר דיסולפידי כמו SPACA6.רק ל-SPACA1 יש תחום דמוי Ig דומה.AlphaFold צופה של-SPACA3, SPACA4 ו-SPACA5 מבנה שונה לחלוטין מזה של SPACA6.מעניין לציין ש- SPACA4 ידוע גם כממלא תפקיד בהפריה, אך במידה רבה יותר מ- SPACA6, במקום זאת מקל על האינטראקציה בין הזרע והביצית zona pellucida52.
החיפוש שלנו AlphaFold מצא התאמה נוספת עבור IZUMO1 ו- SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, חלבון טרנסממברנלי יחיד ספציפי לזרע, הופך עכברים זכרים לעקרים כשהם מובטלים 32,33.לזרעונים חסרי TMEM95 היו מורפולוגיה, תנועתיות תקינה ויכולת לחדור לזונה pellucida ולהיקשר לקרום הביצית, אך לא יכלו להתמזג עם קרום הביצית.מחקרים קודמים הראו ש-TMEM95 חולק קווי דמיון מבניים עם IZUMO133.ואכן, מודל AlphaFold אישר ש-TMEM95 הוא 4HB עם אותו זוג של מוטיבים של CXXC כמו IZUMO1 ו- SPACA6 ואותו קשר דיסולפיד נוסף בין סלילים 1 ו-2 שנמצא ב-SPACA6 (איור 3a ו-S11).למרות ש-TMEM95 חסר תחום דמוי Ig, יש לו אזור עם דפוס קשר דיסולפיד הדומה לאזורי הצירים SPACA6 ו-IZUMO1 (איור 3b).בזמן פרסום כתב היד הזה, שרת ה-preprint דיווח על המבנה של TMEM95, ואישר את תוצאת AlphaFold53.TMEM95 דומה מאוד ל-SPACA6 ול-IZUMO1 והוא נשמר מבחינה אבולוציונית כבר בדו-חיים (איור 4 ו-S13).
החיפוש PSI-BLAST השתמש במסדי הנתונים NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP ו-SOF1 כדי לקבוע את מיקומם של רצפים אלו בעץ החיים.מרחקים בין נקודות הסתעפות אינם מוצגים בקנה מידה.
הדמיון המבני הכולל הבולט בין SPACA6 ו-IZUMO1 מצביע על כך שהם חברים מייסדים של משפחת-על מבנית משומרת הכוללת את החלבונים TMEM95 ו-IZUMO 2, 3 ו-4.חברים ידועים: IZUMO1, SPACA6 ו-TMEM95.מכיוון שרק לכמה חברים יש תחומים דמויי Ig, סימן ההיכר של משפחת העל IST הוא תחום 4HB, בעל תכונות ייחודיות המשותפות לכל החלבונים הללו: 1) מפותל 4HB עם סלילים מסודרים בחילופין אנטי מקביל/מקביל (איור 5א), 2) לצרור יש פנים משולשים המורכבים משני סלילים בתוך הצרור וסליל אנכי שלישי (אזור מפתח איור (איור 5c). ידוע כי מוטיב CXXC, המצוי בחלבונים דמויי תיורדוקסין, מתפקד כמו חיישן חיזור 54,55,56, בעוד המוטיב בבני משפחת IST יכול להיות קשור לאיזומראזות חלבון דיסולפיד כגון ERp57 בהיתוך גמטות.תפקידים קשורים 57,58.
חברי משפחת העל של IST מוגדרים על ידי שלוש מאפיינים אופייניים של תחום 4HB: ארבעה סלילים המתחלפים בין אוריינטציה מקבילה לאנטי-מקבילה, פרצופים של צרור סלילי ba-משולש ומוטיב כפול כ-CXXC שנוצר בין מולקולות קטנות.) סלילים N-טרמינליים (כתום) ואזור ציר β-סיכת שיער (ירוק).
לאור הדמיון בין SPACA6 ל-IZUMO1, נבדקה יכולתם של הראשונים להיקשר ל-IZUMO1 או JUNO.Interferometry של שכבת ביולוגית (BLI) היא שיטת קישור מבוססת קינטית ששימשה בעבר כדי לכמת את האינטראקציה בין IZUMO1 ל-JUNO.לאחר דגירה של החיישן המסומן ביוטין עם IZUMO1 כפיתיון עם ריכוז גבוה של אנליט JUNO, זוהה אות חזק (איור S14a), המעיד על שינוי המושרה בקשירה בעובי החומר הביולוגי המחובר לקצה החיישן.אותות דומים (כלומר, JUNO מצמידים לחיישן כפיתיון נגד אנליט IZUMO1) (איור S14b).לא זוהה אות כאשר SPACA6 שימש כאנליט נגד IZUMO1 הקשור לחיישן או JUNO הקשור לחיישן (איור S14a,b).היעדר אות זה מצביע על כך שהתחום החוץ-תאי של SPACA6 אינו מקיים אינטראקציה עם התחום החוץ-תאי של IZUMO1 או JUNO.
מכיוון שבדיקת BLI מבוססת על ביוטינילציה של שאריות ליזין חופשיות על חלבון הפיתיון, שינוי זה יכול למנוע התקשרות אם שאריות ליזין מעורבות באינטראקציה.בנוסף, כיוון הקישור ביחס לחיישן יכול ליצור מכשולים סטריים, ולכן בוצעו מבחני משיכה קונבנציונליים גם ב-SPACA6, IZUMO1 ו-JUNO אקטודומיין רקומביננטי.למרות זאת, SPACA6 לא ירד עם IZUMO1 מתויג His או JUNO (איור S14c,d), מה שמצביע על שום אינטראקציה עקבית עם זו שנצפתה בניסויי BLI.כביקורת חיובית, אישרנו את האינטראקציה של JUNO עם התווית His IZUMO1 (איורים S14e ו- S15).
למרות הדמיון המבני בין SPACA6 ל-IZUMO1, חוסר היכולת של SPACA6 לקשור את JUNO אינו מפתיע.לפני השטח של IZUMO1 האנושי יש יותר מ-20 שיירים המקיימים אינטראקציה עם JUNO, כולל שיירים מכל אחד משלושת האזורים (אם כי רובם ממוקמים באזור הציר) (איור S14f).מתוך שאריות אלו, רק אחד נשמר ב- SPACA6 (Glu70).בעוד שתחליפים רבים של שאריות שמרו על המאפיינים הביוכימיים המקוריים שלהם, שייר Arg160 החיוני ב-IZUMO1 הוחלף ב-Asp148 הטעון שלילי ב-SPACA6;מחקרים קודמים הראו שהמוטציה של Arg160Glu ב-IZUMO1 מבטלת כמעט לחלוטין את הקישור ל-JUNO43.בנוסף, ההבדל בכיוון התחום בין IZUMO1 ל- SPACA6 הגדיל באופן משמעותי את שטח הפנים של אתר הקישור JUNO של האזור המקביל ב- SPACA6 (איור S14g).
למרות הצורך הידוע ב-SPACA6 עבור היתוך גמטות והדמיון שלו ל-IZUMO1, נראה כי ל-SPACA6 אין פונקציית קישור מקבילה ל-JUNO.לכן, ביקשנו לשלב את הנתונים המבניים שלנו עם עדויות לחשיבות שמספקת הביולוגיה האבולוציונית.יישור רצף של הומולוגיות SPACA6 מראה את שימור המבנה המשותף מעבר ליונקים.לדוגמה, שאריות ציסטאין קיימות אפילו בדו-חיים קרובים רחוקים (איור 6א).באמצעות שרת ConSurf, נתוני שימור יישור רצף מרובים של 66 רצפים מופו למשטח SPACA6.סוג זה של ניתוח יכול להראות אילו שאריות נשמרו במהלך התפתחות החלבון ויכול להצביע על אילו אזורי פני השטח משחקים תפקיד בתפקוד.
יישור רצף של אקטודומיינים SPACA6 מ-12 מינים שונים שהוכנו באמצעות CLUSTAL OMEGA.לפי ניתוח ConSurf, העמדות השמרניות ביותר מסומנות בכחול.שאריות ציסטאין מסומנות באדום.גבולות תחום ואלמנטים של מבנה משני מוצגים בחלק העליון של היישור, כאשר חיצים מציינים גדילי β וגלים מציינים סלילים.מזהי הגישה של NCBI המכילים את הרצפים הם: אנושי (Homo sapiens, NP_001303901), מנדריל (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), קוף קפוצ'ין (Cebus mimic, XP_017359366), סוס (Equus caballus, XP6_02235 killer0_0223, XP6_02235, XP6_02235, XP6_0235, XP_01821277) 032_034).), כבשה (Ovis aries, XP_014955560), פיל (Loxodonta africana, XP_010585293), כלב (Canis lupus familyis, XP_025277208), עכבר (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil, XPiSarcophilus1, XPiSarcophilus1, XPi331, XPi31 ), פלטיפוס, 8) , 61_89 ו-Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).המספור מבוסס על סדר אנושי.ב ייצוג פני השטח של מבנה SPACA6 עם 4HB בחלק העליון ותחום דמוי Ig בחלק התחתון, צבעים המבוססים על הערכות שימור משרת ConSurf.החלקים השמורים ביותר הם בצבע כחול, החלקים השמורים בצורה בינונית הם בלבן, והפחות השתמרו בצבע צהוב.ציסטאין סגול.שלושה טלאים משטחים המדגימים רמת הגנה גבוהה מוצגים בתיקונים המסומנים בתווית 1, 2 ו-3. קריקטורה 4HB מוצגת בתוספת בצד ימין למעלה (אותה ערכת צבעים).
למבנה SPACA6 יש שלושה אזורי שטח שמורים מאוד (איור 6b).תיקון 1 משתרע על פני 4HB ואזור הציר ומכיל שני גשרי CXXC דיסולפידים שמורים, רשת צירים Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (איור S7), ושלושה שיירים ארומטיים חיצוניים שמורים (Phe31, Tyr73, Phe137)).שפה רחבה יותר של התחום דמוי ה-Ig (איור S6e), המייצגת כמה שיירים בעלי מטען חיובי על פני הזרע.מעניין לציין שהמדבקה הזו מכילה אפיטופ נוגדנים שהוכח בעבר כמפריע לתפקוד SPACA6 30.אזור 3 משתרע על הציר וצד אחד של התחום דמוי Ig;אזור זה מכיל פרולינים משומרים (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ושאריות קוטביות/טעונות הפונות כלפי חוץ.באופן מפתיע, רוב השאריות על פני השטח של 4HB משתנים מאוד (איור 6b), אם כי הקפל נשמר לאורך ההומלוג SPACA6 (כפי שמצוין על ידי השמרנות של ליבת הצרור ההידרופובי) ומעבר למשפחת העל IST.
למרות שזהו האזור הקטן ביותר ב- SPACA6 עם הכי מעט אלמנטים של מבנה משני שניתן לזהות, שרידי אזורי צירים רבים (כולל אזור 3) נשמרים מאוד בקרב ההומולוגיות של SPACA6, מה שעשוי להצביע על כך שהכיוון של הצרור הסלילי ושל ה-β-סנדוויץ' משחק תפקיד.בתור שמרן.עם זאת, למרות קשרי מימן נרחבים ורשתות אלקטרוסטטיות באזור הצירים של SPACA6 ו-IZUMO1, ניתן לראות עדות לגמישות מהותית ביישור המבנים המותרים המרובים של IZUMO137,43,44.היישור של התחומים הבודדים חפף היטב, אך הכיוון של התחומים זה ביחס לזה השתנה בין 50° ל-70° מהציר המרכזי (איור S16).כדי להבין את הדינמיקה הקונפורמטיבית של SPACA6 בתמיסה, בוצעו ניסויי SAXS (איור S17a,b).שחזור אב initio של האקטודומיין SPACA6 תואם למבנה גבישי מוט (איור S18), אם כי העלילה של Kratky הראתה מידה מסוימת של גמישות (איור S17b).קונפורמציה זו מנוגדת ל-IZUMO1, שבו החלבון הבלתי קשור מקבל צורת בומרנג הן בסריג והן בתמיסה43.
כדי לזהות באופן ספציפי את האזור הגמיש, בוצעה ספקטרוסקופיה מסה חילופי מימן-דאוטריום (H-DXMS) על SPACA6 והשוותה לנתונים שהושגו בעבר על IZUMO143 (איור 7a,b).SPACA6 בבירור גמיש יותר מ-IZUMO1, כפי שמצוין על ידי חילופי דויטריום גבוהים יותר בכל המבנה לאחר 100,000 שניות של החלפה.בשני המבנים, החלק ה-C-terminal של אזור הציר מראה רמה גבוהה של חילוף, מה שמאפשר כנראה סיבוב מוגבל של תחומים דמויי 4HB ו-Ig ביחס זה לזה.מעניין לציין כי החלק ה-C-terminal של ציר SPACA6, המורכב משריד 147CDLPLDCP154, הוא אזור שמור מאוד 3 (איור 6b), אולי מעיד על כך שגמישות בין-דומיין היא תכונה משומרת אבולוציונית של SPACA6.על פי ניתוח הגמישות, נתוני התכה תרמית של CD הראו ש-SPACA6 (Tm = 51.2°C) פחות יציב מ-IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (איור S1e ו-S19).
תמונות a H-DXMS של SPACA6 ו-b IZUMO1.אחוז חילופי הדוטריום נקבע בנקודות הזמן המצוינות.רמות חילופי מימן-דאוטריום מסומנות לפי צבע בסולם שיפוע מכחול (10%) לאדום (90%).קופסאות שחורות מייצגות אזורים של תמורה גבוהה.הגבולות של 4HB, ציר ותחום דמוי Ig שנצפו במבנה הגבישי מוצגים מעל הרצף הראשוני.רמות חילופי דאוטריום ב-10 שניות, 1000 שניות ו-100,000 שניות שורטטו על תרשים רצועות שהונח על המשטחים המולקולריים השקופים של SPACA6 ו-IZUMO1.חלקים של מבנים עם רמת חילופי דאוטריום מתחת ל-50% צבועים לבן.אזורים מעל 50% חילופי H-DXMS נצבעים בסולם שיפוע.
השימוש באסטרטגיות גנטיות של CRISPR/Cas9 ואסטרטגיות נוק-אאוט של גן עכבר הוביל לזיהוי של מספר גורמים חשובים לקשירה ואיחוי זרע וביצית.מלבד האינטראקציה המאופיינת היטב של מבנה IZUMO1-JUNO ו-CD9, רוב החלבונים הקשורים לאיחוי הגמטה נותרים חידתיים מבחינה מבנית ופונקציונלית.האפיון הביופיזי והמבני של SPACA6 הוא חלק נוסף בפאזל הדבקה/היתוך מולקולרי במהלך ההפריה.
נראה כי SPACA6 וחברים אחרים במשפחת העל IST נשמרים מאוד ביונקים וכן בציפורים בודדות, זוחלים ודו-חיים;למעשה, נהוג לחשוב ש-SPACA6 אפילו נדרש להפריה בדג הזברה 59. התפלגות זו דומה לחלבונים ידועים אחרים הקשורים לאיחוי גמטות כגון DCST134, DCST234, FIMP31 ו-SOF132, מה שמרמז על כך שגורמים אלה הם חסרי HAP2 (גם המכונה GCS1) חלבונים שאחראים על הפעילות הקטליטית של פרוטיסטים רבים., צמחים ופרוקי רגליים.חלבוני היתוך מופריים 60, 61. למרות הדמיון המבני החזק בין SPACA6 ו-IZUMO1, נוק-אאוט של גנים המקודדים לכל אחד מהחלבונים הללו הביא לאי פוריות בעכברים זכרים, מה שמעיד על כך שתפקודיהם בהיתוך גמטות אינם משוכפלים..באופן רחב יותר, אף אחד מחלבוני הזרע הידועים הדרושים לשלב ההדבקה של היתוך אינו מיותר.
נותרה שאלה פתוחה אם SPACA6 (וחברים אחרים במשפחת העל של IST) משתתפים בצמתים בין-גמטיים, יוצרים רשתות תוך-גמטיות כדי לגייס חלבונים חשובים לנקודות היתוך, או אולי אפילו פועלים כפוסוגנים חמקמקים.מחקרי שילוב אימוניות בתאי HEK293T חשפו אינטראקציה בין IZUMO1 באורך מלא ו- SPACA632.עם זאת, האקטודומיינים הרקומביננטיים שלנו לא קיימו אינטראקציה במבחנה, מה שמרמז על האינטראקציות שנראו אצל Noda et al.שניהם נמחקו במבנה (שימו לב לזנב הציטופלזמי של IZUMO1, אשר הוכח כלא הכרחי להפריה62).לחלופין, IZUMO1 ו/או SPACA6 עשויים לדרוש סביבות מחייבות ספציפיות שאיננו משכפלים במבחנה, כגון קונפורמציות ספציפיות מבחינה פיזיולוגית או קומפלקסים מולקולריים המכילים חלבונים אחרים (ידועים או שטרם התגלו).למרות שמאמינים שהאקטודומיין IZUMO1 מתווך התקשרות של spermatozoa לביצית בחלל הפריוויטליני, המטרה של האקטודומיין SPACA6 אינה ברורה.
המבנה של SPACA6 חושף מספר משטחים משומרים שעשויים להיות מעורבים באינטראקציות חלבון-חלבון.בחלק השמור של אזור הציר הסמוך מיד למוטיב CXXC (המוגדר תיקון 1 לעיל) יש כמה שאריות ארומטיות הפונות כלפי חוץ אשר קשורות לעתים קרובות לאינטראקציות הידרופוביות ו-π-ערימה בין ביומולקולות.הצדדים הרחבים של התחום דמוי ה-Ig (אזור 2) יוצרים חריץ טעון חיובי עם שיירי Arg ו-His שמורים מאוד, ונוגדנים נגד אזור זה שימשו בעבר לחסימת היתוך גמטות 30.הנוגדן מזהה את האפיטופ הליניארי 212RIRPAQLTHRGTFS225, שיש לו שלושה מתוך ששת שיירי הארגינין ו- His220 שמורים מאוד.לא ברור אם התפקוד לקוי נובע מחסימה של שאריות ספציפיות אלו או מהאזור כולו.מיקומו של הפער הזה בסמוך לקצה ה-C של ה-β-סנדוויץ' מצביע על אינטראקציות cis עם חלבוני זרע שכנים, אך לא עם חלבוני ביציות.יתר על כן, השמירה של סבך עשיר בפרולין גמיש ביותר (אתר 3) בתוך הציר עשויה להיות האתר של אינטראקציה חלבון-חלבון או, סביר יותר, להצביע על שמירת הגמישות בין שני התחומים.המגדר חשוב לתפקיד הלא ידוע של SPACA6.היתוך של גמטות.
ל-SPACA6 תכונות של חלבוני הידבקות בין-תאיים, כולל כריכים דמויי β.לחלבונים דביקים רבים (למשל, קדהרינים, אינטגרינים, אדהסינים ו-IZUMO1) יש תחום β-סנדוויץ' אחד או יותר שמרחיבים חלבונים מקרום התא אל היעדים הסביבתיים שלהם63,64,65.התחום דמוי ה-Ig של SPACA6 מכיל גם מוטיב שנמצא בדרך כלל בסנדוויצ'ים β של הידבקות ולכידות: כפולות של גדילים מקבילים בקצוות של כריכים מסוג β, הידועים בתור מהדקים מכניים66.מאמינים שמוטיב זה מגביר את ההתנגדות לכוחות גזירה, דבר בעל ערך עבור חלבונים המעורבים באינטראקציות בין-תאיות.עם זאת, למרות הדמיון הזה לאדהסינים, אין כרגע עדות לכך ש-SPACA6 יוצר אינטראקציה עם חלבוני ביצה.האקטודומיין SPACA6 אינו מסוגל להיקשר ל-JUNO, ותאי HEK293T המבטאים SPACA6, כפי שמוצג כאן, כמעט ולא מקיימים אינטראקציה עם ביציות חסרות אזור 32.אם SPACA6 אכן יוצר קשרים אינטרגמטיים, אינטראקציות אלו עשויות לדרוש שינויים לאחר תרגום או ייצוב על ידי חלבוני זרע אחרים.לתמיכה בהשערה האחרונה, זרעונים חסרי IZUMO1 נקשרים לביציות, מה שמדגים שמולקולות אחרות מלבד IZUMO1 מעורבות בשלב היצמדות הגמטות 27.
לחלבוני היתוך נגיפיים, תאיים והתפתחותיים רבים יש תכונות המנבאות את תפקודם כ-fusogens.לדוגמה, לגליקופרוטאינים של היתוך נגיפי (מחלקות I, II ו-III) יש פפטיד היתוך הידרופובי או לולאה בקצה החלבון המוחדר לממברנת המארח.מפת ההידרופיליות של IZUMO143 והמבנה (נקבע וחזוי) של משפחת העל IST לא הראו פפטיד היתוך הידרופובי לכאורה.לפיכך, אם חלבונים כלשהם במשפחת העל IST מתפקדים כפוסוגנים, הם עושים זאת בצורה שונה מדוגמאות ידועות אחרות.
לסיכום, הפונקציות של חברי משפחת-העל IST של חלבונים הקשורים להיתוך גמטות נותרו בגדר תעלומה מגרה.מולקולת רקומביננטית SPACA6 המאופיינת שלנו והמבנה המוסדר שלה יספקו תובנה לגבי הקשרים בין המבנים המשותפים הללו ותפקידם בהתקשרות ובהיתוך גמטים.
רצף ה-DNA התואם לאקטודומיין SPACA6 האנושי החזוי (מספר כניסה של NCBI NP_001303901.1; שיירים 27-246) עבר אופטימיזציה לקודון לביטוי בתאי Drosophila melanogaster S2 וסונתז כשבר גן עם הרצף המקודד לקוזק (Eurofins Genomics)., אות הפרשת BiP וקצוות 5' ו-3' התואמים לשיבוט בלתי תלוי של גן זה לתוך וקטור ביטוי pMT המבוסס על פרומוטור metallothionein שונה לבחירה עם puromycin (pMT-puro).וקטור pMT-puro מקודד לאתר מחשוף תרומבין ואחריו תג 10x-His C-terminal (איור S2).
טרנספקציה יציבה של וקטור SPACA6 pMT-puro לתוך תאי D. melanogaster S2 (Gibco) בוצעה בדומה לפרוטוקול המשמש עבור IZUMO1 ו-JUNO43.תאי S2 הופשרו וגודלו במדיום של שניידר (Gibco) בתוספת ריכוז סופי של 10% (v/v) סרום עגל עוברי מושבת בחום (Gibco) ו-1X אנטיביוטיקה אנטי-מיקוטית (Gibco).תאי מעבר מוקדם (3.0 x 106 תאים) צופו בבארות בודדות של צלחות 6-בארות (Corning).לאחר 24 שעות של דגירה ב-27 מעלות צלזיוס, התאים הועברו בתערובת של 2 מ"ג של SPACA6 pMT-puro vector ו- Effectene transfection reagent (Qiagen) לפי פרוטוקול היצרן.תאים שעברו דגירה הודגרו במשך 72 שעות ולאחר מכן נקצרו עם 6 מ"ג/מ"ל פורומיצין.לאחר מכן בודדו תאים ממדיום שלם של שניידר והונחו במדיום Insect-XPRESS ללא סרום (Lonza) לייצור חלבון בקנה מידה גדול.אצווה של 1 ליטר של תרבית תאים S2 גדלה לתאים של 8-10 × 106 מ"ל-1 בבקבוק פוליפרופילן מאוורר עם תחתית שטוחה של 2 ליטר ולאחר מכן עוקרה עם ריכוז סופי של 500 מיקרומטר CuSO4 (Millipore Sigma) וסונן סטרילי.מושרה.התרבויות המושרות הודגרו ב-27 מעלות צלזיוס ב-120 סל"ד למשך ארבעה ימים.
מדיום מותנה המכיל SPACA6 בודד על ידי צנטריפוגה ב-5660×g ב-4°C ואחריו מערכת סינון זרימה משיקית Centramate (Pall Corp) עם ממברנה של 10 kDa MWCO.החל מדיום מרוכז המכיל SPACA6 על עמודה של 2 מ"ל Ni-NTA agarose resin (Qiagen).שרף Ni-NTA נשטף עם 10 נפחי עמודה (CV) של חיץ A ולאחר מכן נוספה 1 CV של חיץ A כדי לתת ריכוז אימידאזול סופי של 50 mM.SPACA6 נחלץ עם 10 מ"ל של חיץ A בתוספת אימידאזול לריכוז סופי של 500 מ"מ.תרומבין בדרגת הגבלה (Millipore Sigma) נוספה ישירות לצינור הדיאליזה (MWCO 12-14 kDa) ביחידה אחת למ"ג SPACA6 לעומת 1 ליטר 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ו-150 mM NaCl (חיץ B) לדיאליזה.) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.לאחר מכן, ה-SPACA6 המפוצל בתרומבין דולל פי שלושה כדי להפחית את ריכוז המלח והועמס על עמודה של 1 מ"ל MonoS 5/50 GL חילופי קטונים (Cytiva/GE) מאוזנת עם 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.מחליף הקטיונים נשטף עם 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, ולאחר מכן SPACA6 נפלטה עם שיפוע ליניארי מ-0 עד 500 מ"מ NaCl ב-10 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5 עבור 25 OK.לאחר כרומטוגרפיה של חילופי יונים, SPACA6 רוכז ל-1 מ"ל ונפלט בצורה איזוקרטית מעמודת ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) מאוזנת עם חיץ B. על פי הכרומטוגרמה, אסף ותרכיז שברים המכילים SPACA6.הטוהר נשלט על ידי אלקטרופורזה מוכתמת Coomassie על ג'ל 16% SDS-polyacrylamide.ריכוז החלבון הוכמת על ידי ספיגה ב-280 ננומטר באמצעות חוק Beer-Lambert ומקדם ההכחדה הטוחני התיאורטי.
SPACA6 מטוהר עבר דיאליזה למשך הלילה כנגד 10 מ"מ נתרן פוספט, pH 7.4 ו-150 מ"מ NaF ומדולל ל-0.16 מ"ג/מ"ל לפני ניתוח באמצעות ספקטרוסקופיה CD.סריקה ספקטרלית של תקליטורים עם אורך גל של 185 עד 260 ננומטר נאספה ב-Jasco J-1500 ספקטרופולרימטר באמצעות קובטות קוורץ באורך נתיב אופטי של 1 מ"מ (Helma) ב-25°C בקצב של 50 ננומטר לדקה.ספקטרום ה-CD תוקנו בקו הבסיס, נמדדו בממוצע על פני 10 רכישות, והומרו לאליפטיות שיורית ממוצעת (θMRE) במעלות cm2/dmol:
כאשר MW הוא המשקל המולקולרי של כל דגימה ב-Da;N הוא מספר חומצות האמינו;θ היא האליפטיות במילי מעלות;d מתאים לאורך הנתיב האופטי בס"מ;ריכוז חלבון ביחידות.