347 רכיבים כימיים של צינורות מפותלים מפלדת אל-חלד, זיהוי של חלבוני מלווה אנטיגן לויקוציטים אנושיים אנטיגן-A (HLA-A) חדשים המגיבים לאינטרפרון באמצעות ספקטרומטריית מסה צולבת (CLMS)

תודה שביקרת ב-Nature.com.אתה משתמש בגרסת דפדפן עם תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בנוסף, כדי להבטיח תמיכה שוטפת, אנו מציגים את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
סליידרים המציגים שלושה מאמרים בכל שקופית.השתמש בלחצנים 'הקודם' וה'הבא' כדי לעבור בין השקופיות, או בלחצני בקר השקופיות שבקצה כדי לעבור בין כל שקופית.

תיאור מוצר

צינורות סליל נירוסטה 347L, דרגת פלדה: SS347L

מערכת איתות האינטרפרון משרה תגובת ציטוקינים חזקה למגוון רחב של אותות פתוגניים ופתולוגיים מהותיים מהסביבה, וכתוצאה מכך אינדוקציה של תת-קבוצות של חלבונים הניתנים להשראת אינטרפרון.הפעלנו ספקטרומטריית מסה צולבת בתיווך DSS (CLMS) כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון חדשות בתחום של חלבונים המושרים על ידי אינטרפרון.בנוסף לחלבונים הצפויים להשראת אינטרפרון, זיהינו גם תוספים אינטר-מולקולריים ותוך-מולקולריים מקושרים חדשים של חלבונים קנוניים הניתנים להשראת אינטרפרון כגון MX1, USP18, OAS3 ו-STAT1.התמקדנו באימות אורתוגונלי של קבוצה חדשה של רשתות חלבון הניתנות להשראת אינטרפרון שנוצרו על ידי חלבוני HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) תוך שימוש ב-co-immunoprecipitation ומחקר נוסף שלהם באמצעות מודלים של דינמיקה מולקולרית.מודלים של הדינמיקה הקונפורמטיבית של קומפלקס החלבון חשף מספר אתרי אינטראקציה ששיקפו את האינטראקציות שזוהו בממצאי CLMS.יחד, אנו מציגים מחקר פיילוט של CLMS לזיהוי מתחמי איתות חדשים המושרים על ידי אינטרפרון, ומצפים לשימוש הרחב יותר ב-CLMS כדי לזהות דינמיקה חדשה של אינטראקציות חלבון במיקרו-סביבה של הגידול.
לפני שמתחילה תגובה חיסונית אדפטיבית, מערכת ההגנה המולדת של המארח מפעילה תגובה אנטי-מיקרוביאלית המתווכת על ידי משפחה של ציטוקינים אלפא-סליליים המופרשים הנקראים אינטרפרונים (IFNs).מחלקות IFN מסוג I IFNα ו-IFNβ מפעילות תגובות תאי, כולל מצבים אנטי-ויראליים, פרואפופטוטיים, פרו-דלקתיים ואנטי-פרוליפרטיביים.בבני אדם ידועים 13 תת-סוגים של IFNα, כולם מקובצים על כרומוזום 91. באופן מפתיע, רק IFNα2 נחקר לשימוש קליני.לאחרונה ניתנה תשומת לב מיוחדת למחקר על תת-סוגים אחרים של IFNα.מחקר שנערך לאחרונה הראה ש-IFNα14 הוא אחד מהאיזופורמים היעילים ביותר בהגבלת שכפול HBV2 ו-HIV-13,4 בהשוואה לתת-הסוג הקנוני של IFNα2.
הוכח שמתחמי קולטני אינטרפרון משופעלים מסוג I (IFNAR1 ו-IFNAR2) מעוררים מפל של העברת אותות המתווך על ידי יאנוס קינאזות TYK2 ו-JAK15,6.Janus kinases אלה פוספורילטים מתמרי אותות ומפעילי חלבון שעתוק (STAT1 ו-STAT2) על שיירי טירוזין כדי ליזום הטרודימריזציה בתיווך תחום SH26.לאחר מכן, IRF9 קושר את הטרודימרים STAT ליצירת קומפלקס טרימרי של הגן של IFN-stimulated factor 3 (ISGF3), אשר עובר לגרעין וגורם לשעתוק של למעלה מ-2000 גנים מעוררי אינטרפרון (ISGs)5,6,7,8.
ISGs מהווים את עמוד השדרה של מערכת החיסון המולדת, במיוחד בתגובה להתקפה ויראלית.כקו הגנה ראשון מפני זיהום ויראלי, תאים פורסים במהירות אינטראקציות נרחבות של חלבונים תאיים עם מגוון רחב של פעילויות ביולוגיות.חלבונים אלה כוללים קולטנים לזיהוי תבניות, מולקולות איתות, גורמי שעתוק וחלבונים בעלי פונקציות אנטי-ויראליות ישירות, כמו גם מווסתים שליליים של תגובות חיסון9.חלק גדול מהמידע על פעילות ISG מגיע ממסכים תפקודיים המשתמשים במסכי ביטוי יתר10,11 או בטכניקות השתקת גנים (siRNA, RNAi ו-CRISPR)12,13 שבהן מתבטאים או מעוכבים ISGs בודדים ופעילותם נבדקת על וירוסים שונים.למרות שמחקרים אלה קבעו את התכונות האנטי-ויראליות של ISGs בודדים, המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של כל ISG נותרו לא ידועים במידה רבה.מקובל בדרך כלל שחלבונים רבים מקיימים אינטראקציה עם ציטוקינים אחד או יותר כדי להבטיח פעילות מלאה, כך ש-ISG מקיים אינטראקציה ישירה או שהאינטראקציות שלהם מתווכות על ידי חלבונים תאיים.לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה על פרוטאומיקה באמצעות photocrosslinked זיהה את ATPase VCP/p97 כשותף אינטראקציה עיקרי של IFITM3, שעיכוב מוביל לפגמים במיון ליזוזומלי, תחלופה והובלה משותפת של IFITM3 עם חלקיקים ויראליים 14 .באמצעות משקעים חיסוניים, זיהינו את VAPA, חלבון הקשור לשלפוחית, כשותף אינטראקציה עם IFITM1/2/3 המתווך התבגרות ויראלית בתיווך כולסטרול, וזה אושר על ידי מחקר אחר באמצעות מערכת דו-היברידית של שמרים.תמיכה מדעית 15 , 16 .
תהליך ביולוגי בסיסי המעורב בדיכוי של זיהום וטרנספורמציה ממאירה הוא הצגת אנטיגן, המתווך על ידי מולקולות היסטו-תאימות עיקריות (MHC).פפטידים (8-12 חומצות אמינו באורך) מחלבונים מפוצלים, שהסתיימו בטרם עת או מקופלים בצורה שגויה, נטענים בהטרודימר MHC-I (המורכב משרשראות כבדות וקלות של MHC-I, הנקראות β-2-microglobulin; β2M) 17,18.הטרימרים היציבים של MHC-I המתקבלים מועברים אל פני התא, שם הם מציגים פפטידים תוך תאיים לתאי CD8+ T (תאי T ציטוטוקסיים)17.תאי T מזהים ומשמידים פתוגנים אלה ותאים הנושאים אנטיגן ספציפי לגידול.כתוצאה מכך, פתוגנים ותאי גידול מדכאים לעתים קרובות את תהליך הצגת האנטיגן כדי להימנע ממעקב חיסוני.בנוסף, MHC-I מוחל ב-40-90% מהגידולים בבני אדם ולעיתים קרובות קשור לפרוגנוזה גרועה יותר19.
גנים המעורבים בתגובה לפתוגנים חייבים לעבור במהירות בין מצב מנוחה למצב של שעתוק פעיל.לכן, מספר חלבונים תאיים משוערים להיות מעורבים בתגובה לביקוש גבוה ל-IFN על פני תקופות זמן קצרות, כולל שיפוץ ושינוי של כרומטין פרומטור 20,21.רוב המחקרים התמקדו בזיהוי של שותפי חלבון ISG בודדים בנוכחות IFN.מספר מחקרים פרוטאומיים וטרנסקריפטומיים במערכות תאים מודל הבהירו את ההשפעה של IFN על הנוף הסלולרי.עם זאת, למרות ההבנה הגוברת של הדינמיקה המושרה על ידי אינטרפרונים, אנחנו עדיין יודעים מעט על המעורבות של ISGs.כאשר בוחנים את המורכבות והדינמיקה התלויה בזמן של איתות אינטרפרון, עולות שתי שאלות: (i) האם ניתן לייצב וללכוד את מתחמי הרב-חלבון המעורבים באיתות מהיר, ו-(ii) האם ניתן למפות את האינטראקציות הללו לתוך המרחב התלת-ממדי?
כדי לטפל בבעיות אלו, יישמנו קישור כימי (DSS) בתיווך דיסוצ'ינימיד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (CLMS) כדי לחקור את רשת האינטראקציה של חלבון המושרה על ידי IFNα והדינמיקה שלה.DSS מוסיף קשרים קוולנטיים בין שיירים פרוקסימליים של חלבונים ו/או קומפלקסים חלבונים in vivo.ניתוח טרשת נפוצה שלאחר מכן מגלה אתרים צולבים ספציפיים המשקפים את הקרבה המרחבית של אזורים בתוך חלבון מסוים, הנקראים קישורים פנימיים, או תת-יחידות במתחמי חלבון, הנקראים קשרי גומלין.באמצעות גישה זו, זיהינו מספר קומפלקסים חדשים של חלבון-חלבון, כמו גם רשתות אינטראקציה מולטי-חלבון הנגרמות על ידי אינטרפרון.על ידי בדיקה נוספת של תת-קבוצה של אינטראקציות חדשות אלה, אנו מדגימים כי H2BFS (FS H2B היסטון מסוג FS; להלן H2B) ו-MDN1 פועלים כשותפים מחייבים עבור HLA-A.
תאי Flo-1 הם אחד המודלים המוכרים ביותר במבחנה של אדנוקרצינומה של הוושט, מכיוון שהם מחקים תכונות מפתח של גידולים בוושט22,23.עם זאת, לא כל הגידולים הם אימונוגניים, וכדי לקבוע אם תאי Flo-1 מגיבים לטיפול באינטרפרון, טיפלנו בתאי Flo-1 ב-10 ng/ml IFNα במשך 72 שעות.תאי Flo-1 הראו אינדוקציה מוקדמת של pSTAT1 ו-IRF1, החל 2 שעות לאחר הטיפול והמשכו במשך 72 שעות, עם ירידה תלוית זמן ברמות הנייחות של IRF1 (איור 1A).נמצא כי ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2 ו- ISG15) נגרמות בעוצמה לאחר 6 שעות, תוך חיקוי התגובות הקלאסיות בשלב האמצע והמאוחר ל-IFNα (איור 1A).יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש במודל הסלולרי הזה כדי לחקור את תגובות האינטרפרון.
תגובות ביטוי חלבון דיפרנציאלי בתאי Flo-1 לאחר טיפול ב-IFNα.(א) ביטוי חלבון בתאי Flo-1 שטופלו ב-10 ng/ml IFNα במשך 2, 6, 24, 48 ו-72 שעות נותח על ידי immunoblot באמצעות נוגדני ISG המצוינים.(ב) ג'לים SDS-PAGE בצבע כחול Coomassie של תמציות תאים שלמים לאחר הצלבה עם DSS לזמנים וריכוזים שצוינו.(ג) אימונובלוט נציג נבדק עם נוגדן p53(DO-1) מאותן דגימות כדי להעריך את מידת הצלבות החלבון.
כדי ללכוד את נוף האינטראקציה של החלבון באתרו, השתמשנו ב-DSS, חומר מקשרים צולב בשימוש נרחב בשל חדירות הממברנה הגבוהה שלו וזמן תגובה קצר יחסית.זמן התגובה הקצר יותר עוזר למנוע היווצרות של אגרגטים גדולים של חלבונים מצולבים, ובכך שומר על יציבות המצלב.כדי לקבוע את ריכוז ה-DSS האופטימלי ולהימנע מהצלבות יתר, חשפנו תחילה את התאים ל-5, 2.5 ו-1 mM DSS למשך 5, 10, 5 ו-30 דקות, בהתאמה, וניתחנו את הליסאטים על ידי SDS-PAGE מוכתם Coomassie (לא מוצגים נתונים).נראה כי ליזטים של תאים מקושרים מאוד בריכוז הנמוך ביותר ובנקודת הזמן הקצרה ביותר.לכן, DSS עבר טיטרציה ל-1, 0.5 ו-0.1 mM במשך 5 דקות (איור 1B).הצלבה אופטימלית נצפה עם 0.5 mM DSS למשך 5 דקות, ותנאים אלה נבחרו עבור תאים שטופלו ב-IFNα.בנוסף, איור 1C מציג כתם מערבי שבוצע באמצעות נוגדן p53 (DO-1) כדי להעריך את מידת הצלבות החלבון.
תאי Flo-1 טופלו ב-10 ng/ml IFNα במשך 24 שעות לפני הוספת ה-crosslinker.תאים מקושרים צולבים חולקו לאחר מכן על ידי פרוטאוליזה דו-שלבית וחלבונים עובדו על ידי FASP (איור 2)24,25.פפטידים טריפטיים מקושרים נותחו על ידי ספקטרומטריית מסה (איור 2).לאחר מכן, ספקטרום MS/MS מותאמים לרצף החלבון ומכומתים עם MaxQuant26,27.פפטידים מקושרים זוהו מהספקטרום שהתקבל באמצעות תוכנית SIM-XL, ותרכובות בודדות שולבו לרשת מורכבת באמצעות צינורות תוכנת המחשוב xQuest28 ו-SIM-XL29 בקוד פתוח (איור 2).SIM-XL מזהה אינטראקציות חלבון-חלבון, שרשראות פנימיות ושרשראות בודדות בתערובות חלבון פשוטות או מורכבות ומספקת סקריפטים להמחשת אינטראקציות במבני חלבון.בנוסף, הוא מדרג כל הפניה צולבת כציון מזהה בהתאם לאיכות הספקטרום MS/MS29.זוהו מספר אינטראקציות וקומפלקסים של חלבון-חלבון אמינים ביותר, ומערכת חדשה של אינטראקציות נחקרה עוד יותר באמצעות שילוב אימוני ושינויים קונפורמטיביים של קומפלקסים באמצעות מודלים של דינמיקה מולקולרית (איור 2) 30, 31.
סקירה סכמטית של שיטת CLMS.תאי Flo-1 טופלו ב-10 ng/ml IFNα במשך 24 שעות ולאחר מכן הצלבות חלבון באתרו באמצעות DSS ולאחר מכן תמוגה תאים וטריפסיניזציה.דגימות צולבות נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה Orbitrap ונדגמו עוד יותר עבור פרגמנטציה של מבשרי פפטיד במהלך LC-MS/MS.שני פפטידים מקושרים זוהו מהספקטרום שהתקבל באמצעות מכונת הזיהוי של ספקטרום של התוכנית Crosslinked Peptides (SIM-XL), וכל התרכובות שולבו לרשת מורכבת באמצעות צינורות חישוביים.סנן אינטראקציות עם ביטחון נמוך על סמך ציוני שיעור חיובי שגוי (FDR).מספר אינטראקציות חדשות של חלבון-חלבון בנאמנות גבוהה אושרו עוד יותר באמצעות שילוב אימוני, ושינויים קונפורמטיביים בקומפלקסים נבדקו באמצעות מודלים של דינמיקה מולקולרית (MD).
סך של ~30,500 ו~28,500 פפטידים זוהו באמצעות MaxQuant בדגימות IFNα ללא גירוי ומגורה, בהתאמה (טבלה משלימה S1, איור 3A).התפלגות אורך הפפטידים בשני המקרים הראתה שיעור גבוה יותר של פפטידים גדולים יותר, מה שמצביע על נוכחות של פפטידים מקושרים (איור 3B,C).בנוסף, חלק גדול יותר של פפטידים גדולים יותר היו נוכחים בטווח 40-55 בדגימות שטופלו ב-IFNα (איור 3C).מיפוי חלבון כנגד עוצמת log2 הראה שחלבונים קלאסיים מגורי אינטרפרון היו הנפוצים ביותר בהשוואה לדגימות לא מטופלות, כולל MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 ו- HLA-F (איור 3D).ניתוח של מסלולים לחלבונים המועשרים יותר מפי שלושה בתגובה לטיפול ב-IFNα באמצעות מסד הנתונים של מסלולי Reactome הראה כי הצגה ועיבוד של אנטיגן בתיווך MHC-I היו המסלול הדומיננטי ביותר (איור 3E).בהתאם לדיווחים קודמים, תגובות אנטי-ויראליות בתיווך OAS ו-ISG15 וכן איתות IFNα/β וציטוקינים היו בין המסלולים שהופעלו.בנוסף, זוהו קישורי חלבון ספציפיים לליזין ולסרין מתוך ספקטרום MS/MS שנרכש במקור באמצעות SIM-XL.מחקר שנערך לאחרונה דיווח על 104 ISGs המשתרעים על פני 20 וירוסים מ-9 כיתות וירוסים על ידי מטה-אנליזה של מחקרי ביטוי יתר בודדים של ISG ב-5 סוגי תאים9.עם זאת, כדי להתגבר על המגבלות החישוביות של סינון מערכי נתונים גדולים, התחלנו עם מערך נתונים קטן יותר כדי לחקור אינטראקציות אפשריות בין רשימת הגנים של IRDS שדווחו על ידי Padaria וחב', שרובם הם ISGs.
זיהוי של חלבונים צולבים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית בתגובה ל-IFNα (נתונים שהתקבלו מ-MaxQuant).(א) דיאגרמת Venn המייצגת את מספר הפפטידים הנפוצים והבלעדיים שזוהו בדגימות Flo-1 שטופלו ב-IFNα14 ולא טופלו.התפלגות אורך פפטידים של דגימות מוצלבות לא מטופלות (B) ו-IFNα שטופלו (C).(ד) מפת חום המייצגת log2 (עוצמת LFQ) בין תאי Flo-1 שלא טופלו ל-IFNα14.הלוח השמאלי מציג את החלבונים הפעילים ביותר בנוכחות IFNα.(ה) היסטוגרמה המייצגת את 20 מסלולי ההעשרה העיקריים לאחר טיפול ב-IFNα.מסד הנתונים של מסלולי Reactome ניתח יותר מפי ארבע שינויים בחלבונים מגיבים ל-IFNα.
גירוי ISG בתיווך אינטרפרון מתועד היטב, אך ברמה המולקולרית לא מבינים כיצד חלבונים אלו מגיעים לשיאם במגוון רחב של פונקציות ביולוגיות.חקרנו אינטראקציות של חלבון עם רמה גבוהה של ביטחון בין ISGs ידועים.באופן מעניין, זיהינו רשת הכוללת חלבונים MX1, USP18, ROBO1, OAS3 ו-STAT1 היוצרים קומפלקס גדול בתגובה לטיפול ב-IFNα (איור 4, טבלה S2) 32,33,34.והכי חשוב, אינטראקציות אלו נמצאו בכל העותקים המשולשים שטופלו ב-IFNα ולא נמצאו בדגימות לא מטופלות, מה שמצביע על כך שהן נוצרו במיוחד בתגובה לטיפול ב-IFNα.ידוע כי STAT1 מווסת באופן תעתיק את הביטוי של ISGs אלה, אך האינטראקציה שלו עם ISGs ברמת החלבון לא נחקרה.מבנה הגביש של STAT1 הראה שהתחום הסליל שלו (CCD) אינו מעורב באינטראקציה עם DNA או פרוטומרים במהלך היווצרות דימרים35.סלילי α אלה יוצרים מבנה סליל סליל המספק שטח פנים הידרופילי בעיקר להתרחשות אינטראקציות 35 .בנתוני ה-CLMS שלנו, ראינו שרוב האינטראקציות עם STAT1 התרחשו בתחום SH2 שלפני ה-CCD, תחום הקישור או הזנב המסוף C (שאריות 700-708) (איור 4A).מחקר קודם דיווח ש-USP18 נקשר ל-CCD ול-DNA-binding domain (DBD) של STAT2 ומגוייס לתת-יחידה של קולטן אינטרפרון מסוג I IFNAR2 כדי לתווך עיכוב של איתות אינטרפרון מסוג I 24 .הנתונים שלנו הראו גם שהתחום הקטליטי של USP18 מקיים אינטראקציה עם STAT1 DBD (איור 4A,D), מה שמצביע על כך שגם STAT1 וגם STAT2 עשויים לשחק תפקיד במשיכת USP18 ל-IFNAR2.
רשת חלבון-חלבון ISG שזוהתה בתאים מקושרים שטופלו ב-IFNα.(א) עלילת אינטראקציה דו-ממדית המציגה אינטראקציות חלבון-חלבון (נוצר בתוכנית SIM-XL), עם קווים המייצגים אינטראקציות בין-מולקולריות (חתך צולב מוגדר ל-3.5).דומיינים בעלי זהויות שונות מסומנים לפי color32 שלהם: תחום MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) ו-GED (569–660).תחומים OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) ו-OAS1_C (903-108).דומיין ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) ו-fn3 (777–864).שדות STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) ו-STAT1_TAZ2bind (715–739).(ב) צופה מעגלי של חלבונים מקושרים (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 ו-STAT1) עם אינטראקציות ואינטראקציות מסומנות בכחול ובאדום, בהתאמה.סף ההצלבה נקבע על 3.5.עלילות נקודות מצביעות על אתרי אינטראקציה STAT1 עם MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) ו-OAS3 (F), כמו גם אתרי אינטראקציה K או S בין שני הפפטידים.באיור, סף הניקוד של קישור צולב מוגדר ל-3.0.(ז) אתרי אינטראקציה שונים בין תחומי STAT1 ו- OAS3 DI המוצבים על גבי מבני החלבון שלהם ב-PyMol (מערכת גרפיקה מולקולרית PyMOL, גרסה 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (מזהה pdb: 1bf533) ו-OAS3 (מזהה pdb: 4s3n34).) תכנית.
שתי איזופורמות של USP18 תוארו בבני אדם, חלבון באורך מלא שנמצא בעיקר בגרעין, ואיזופורם ללא תחום N-טרמינלי, USP18-sf, המופץ באופן שווה בציטופלזמה ובגרעין 36.בנוסף, ה-N-terminus צפוי להיות לא מובנה ואינו דורש פעילות איזופפטידאז או קישור ISG1537.רוב האינטראקציות שזוהו במחקר שלנו היו ממוקמות בקצה ה-N של החלבון, מה שמצביע על כך שאינטראקציות אלה כרוכות ב-USP18 באורך מלא (איור 4A,D) ולכן כנראה מתרחשות בגרעין.יתרה מכך, הנתונים שלנו גם מצביעים על כך שקצה ה-N מתמחה באינטראקציות בין חלבון לחלבון.אתר הקישור IFNAR2 ממוקם בין השאריות 312-368, ובמיוחד, אף אחד מהחלבונים בקומפלקס לא נקשר לאזור זה (איור 4A) 37,38.נתונים אלה ביחד מצביעים על כך שתחום המקשר של IFNAR2 נמצא בשימוש בלעדי על ידי חלבון הקולטן.בנוסף, רק OAS3 ו-ROBO1 נמצאו קשורים לתחומים במעלה הזרם של אתר הקישור N-terminus ו-IFNAR2 (איור 4A).
ROBO1 שייך למשפחת העל של אימונוגלובולינים (Ig) של מולקולות איתות טרנסממברניות ומורכב מחמישה תחומי Ig ושלושה תחומי פיברונקטין (Fn) באזור החוץ-תאי.אחרי תחומים חוץ-תאיים אלו, אזור פרוקסימלי ממברנה וסליל טרנס-ממברני יחיד 39. אזור תוך-תאי לא מובנה ממוקם בקצה ה-C ומכיל מוטיבים של רצף שמורים המתווכים קישור לחלבון אפקטור39.האזור המשתרע מחומצות אמינו ~1100 עד 1600 הוא לרוב מופרע.מצאנו ש-MX1 מקיים אינטראקציה עם ROBO1 דרך Ig, Fn ותחומים תוך-תאיים, בעוד שרוב האינטראקציות עם STAT1 מתרחשות בין ה-CCD שלו, תחום הקישור, וה-C-terminus של ROBO1 (איור 4A,E).מצד שני, אינטראקציות עם אזורי קישור DI, DIII ו-OAS3 הופצו ברחבי החלבון ROBO1 (איור 4A).
משפחת חלבוני האוליגואדנילט סינתאז (OAS) מקבלת וקושרת RNA דו-גדילי תוך תאי (dsRNA), עוברת שינויים קונפורמטיביים ומסנתזת אוליגואדנילטים מקושרים 2',5' (2-5 As) 40 .נמצא שבין שלושת ה-OAS, OAS3 מפגין את הזיקה הגבוהה ביותר ל-dsRNA ומסנתז את הכמות הנמוכה ביותר של 2-5 As, שיכול להפעיל RNase L ובכך להגביל את השכפול הוויראלי 41 .משפחת OAS מורכבת מתחומי נוקלאוטיד טרנספראז דמויי פולימראז בטא (pol-β).מחקרים קודמים הראו שהפעילות הקטליטית של התחום C-terminal (DIII) תלויה ב-dsRNA-binding domain (DI), אשר נדרש להפעלת OAS342.ראינו שתחומי ה-DI וה-DII של OAS3 מקיימים אינטראקציה עם CCD ואזור צומת קטן בין SH2 ו-STAT1 TAD (איור 4A,F).שכבת אתרי הצלבה שונים על מבנה החלבון חשפה אינטראקציה בין גליון β ללולאת DBD STAT1 וכיס פתוח או חלל שנוצרו על ידי שאריות 60-75 בתחום DI של OAS3 (איור 4G).הכיוון של החלבונים בקומפלקס הצביע גם על שאף אחת מהאינטראקציות עם OAS3 לא הפריעה ליכולת הקישור ל-DNA של תחום ה-DI שלו (איור S1A).בנוסף, התחום ה-N-טרמינלי של GTPase MX1 מקיים אינטראקציה נרחבת עם תחומי DI ו-DIII של OAS3 (איור 4A).כמו כן, ראינו אינטראקציה בין OAS1 ו-MX1 בכל שלושת החזרות שטופלו ב-IFNα, כאשר תחום OAS1 בודד (גם פעיל קטליטית) קיים אינטראקציה עם כל שלושת תחומי ה-MX1 (איור S2A,B).
חלבוני MX הם חלק ממשפחה גדולה של GTPases דמויי דיניין המכילים תחום N-terminal GTPase הקושר ומיידר את GTP, תחום ביניים המתווך הרכבה עצמית ורוכסן לאוצין מסוף C הפועל כ- GTPase (LZ ).domain effector domain25,43.MX1 נקשר ליחידות משנה של פולימראזות ויראליות כדי לחסום שעתוק של הגן הנגיפי43.בדיקת שמרים דו-היברידית שדווחה בעבר הראתה כי MX1 הקשור ל-PIAS1 מעכב הפעלה של גנים בתיווך STAT1 על ידי חסימת פעילות קושרת DNA ויש לו גם פעילות SUMO E344,45 ליגאז.כאן, אנו מדגימים כי MX1 נקשר ל-STAT1 (איור 4C,D), אולם כיצד אינטראקציה זו משפיעה על הפעלת גנים בתיווך STAT1 בתגובה ל-IFNα זקוק למחקר נוסף.בנוסף, מצאנו גם ש-MX1 קיים אינטראקציה עם IFIT3 ו-DDX60 בכל שלוש החזרות שטופלו ב-IFNα (איור S2C).
DDX60 הוא הליקאז ציטופלזמי המושרה על ידי IFN שדווח בעבר כממלא תפקיד בהשפלה בלתי תלויה ב-RIG-I של RNA46 ויראלי.הוא מקיים אינטראקציה עם RIG-I ומפעיל את האיתות שלו באופן ספציפי לליגנד 46. DDX60 מורכב מתחום DEXD/H-Box helicase ותחום helicase C-terminal הקושרים RNA ויראלי ו-DNA47.רוב האינטראקציות שלו עם MX1 ו-IFIT3 מתרחשות בתוך אזורים ארוכים של N-ו-C-טרמינליים ללא תחומים או מוטיבים קנוניים (איור S2E,F).עם זאת, MX1 קשור גם לתחום ה-DEXD/H-Box helicase (איור S2E).לחלבונים ממשפחת IFIT יש עותקים טנדם של מוטיב הליקס-סיבוב-סליל ייחודי הנקרא טטרפפטיד חוזר (TPR).נמצא כי IFIT3 הוא מאפנן חיובי של איתות RIG-I ומכאן כמרכיב של קומפלקס MAVS.ביחד, הנתונים שלנו מצביעים על כך ש-IFIT3 ו-DDX60 מקיימים אינטראקציה בעיקר באזור שבין TPR 3-6 של IFIT3 ועשויים למלא תפקיד באיתות RIG-I/MAVS (איור S2F).
בהתחשב בכך שההקרנה של הפרוטאומה כולה אינטנסיבית מבחינה חישובית, לאחר מכן סקרנו את כל מסד הנתונים של UniProt האנושי עבור נוכחות של אחת מהחזרות שטופלו ב-IFNα.בהעתק זה מצאנו מספר רשתות אינטראקציה אמינות ביותר עבור HLA-A.ניתוח של מסלולי חלבון שזוהו על ידי ספקטרום MS/MS הראה שעיבוד והצגת אנטיגן מבוסס MHC-I הם המסלול העיקרי המושרה על ידי אינטרפרון (איור 3D).לכן, התמקדנו בחקר אינטראקציות החלבון של מולקולות MHC-I עם רמה גבוהה של ביטחון בכל הדגימות המצולבות.HLA מורכב מתחומים α1, α2 ו- α3 ושרשראות קלות, ומיקרוגלובולין β2 (β2m) הוא חלבון מלווה קבוע49.לאחר ההרכבה ברשת האנדופלזמית, HLA אינו יציב בהיעדר ליגנדים פפטידים50.החריץ מקשר לפפטיד נוצר על ידי תחומים α1 ו-α2 בעלי פולימורפי גבוה וחסר מבנה בצורה לא פפטידית ותחום α351 הפחות פולימורפי יחסית.בנוכחות IFNα, זיהינו שני מתחמי HLA-A: האחד מקיים אינטראקציה עם HMGA1 ו- H2B (איור 5, טבלה S3) והשני מקיים אינטראקציה עם MDN1, LRCH4 ו- H2B (איור 6).
IFNα משרה רשת אינטראקציה HLA-A עם H2B (H2BFS) ו-HMGA1.(א) עלילה דו-ממדית (נוצרת בתוכנת SIM-XL) המתארת ​​סוגים שונים של אינטראקציות בקומפלקס H2B-HLA-A-HMGA1: קישור בין (כחול), קישור (אדום) וקישור בודד (שחור)..תחומים בעלי זהויות שונות מקודדים בצבע 32: H2B (היסטון; 2-102) ו-MHC-I (MHC_1; 25-203, קבוצה C1; 210-290 ו-MHC_I_C; 337-364).סף ההצלבה נקבע על 3.5.עלילות נקודות מציינות אתרי אינטראקציה של HLA-A עם H2B (B) ו-HMGA1 (C), וכן אתרי אינטראקציה K או S בין שני הפפטידים.באיור, סף הניקוד של קישור צולב מוגדר ל-3.0.(ד) קשרים בין חלבונים המוצגים במבנים של חלבוני H2B, HLA-A ו-HMGA1 בתוכנית PyMOL.מבנים אלה עוצבו באמצעות שרת Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ומבני התבנית עבור חלבוני H2B, HLA-A ו-HMGA1 היו 1kx552, 1kj349 ו-2eze55, בהתאמה.
IFNα משרה רשת אינטראקציה של HLA-A עם H2B (H2BFS), MDN1 ו-LRCH4.(א) קישורים תוך-מולקולריים (אדומים) ואינטרמולקולריים (כחול) המוצגים על מפה אינטראקטיבית דו-ממדית (נוצרת בתוכנת SIM-XL) עם MDN1 מיוצג כמעגל.סף ההצלבה נקבע על 3.5.תחומים בעלי זהויות שונות מקודדים בצבע 32: H2B (היסטון; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, קבוצה C1; 210–290 ו- MHC_I_C; 337–364) ו-LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) ו-CH (535–641)).(ב) קשרים בין חלבונים המוצגים במבנים של חלבוני H2B, HLA-A, LRCH4 ו-MDN1 בתוכנית PyMOL.מבנים אלו עוצבו באמצעות שרת Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) עם מבני תבנית 1kx552, 1kj349, 6hlu62 ו-6i2665 עבור חלבוני H2B, HLA-A, LRCH4 ו-MDN1, בהתאמה.עלילות נקודה המציגות אתרי אינטראקציה K או S עבור HLA-A עם H2B (C), LRCH4 (D) ו-MDN1 (E).עבור חלקות, סף הניקוד של קישור צולב נקבע ל-3.0.
בנוסף לשמירה על שלמות הגנום, היסטון H2B מעורב גם בוויסות התעתוק.חלבון H2B מורכב מתחום היסטון מרכזי (HFD) שנוצר על ידי שלושה סלילי α המופרדים על ידי לולאות וזנב C-טרמינלי 41,52.רוב האינטראקציה עם H2B מתרחשת בסליל α1, המספק טרימריזציה עם ההטרודימר HFD (איור 5A,B).למרות שליזינים מעורבים בקשירה ל-DNA, חלק מהליזינים הם גם אתרי אצטילציה או מתילציה חלופיים.לדוגמה, שיירי K43, K46 ו-K57 מ-H2B אינם מעורבים בקישור ישיר של DNA, אלא הם יעדים לשינויים שונים לאחר שעתוק53.באופן דומה, שאריות K44, K47 ו-K57 ב-H2B עשויות למלא תפקיד חלופי בנוכחות IFNα, כולל אינטראקציות עם חלבונים אחרים (איור 5A, B).בנוסף, ההיסטון החוץ-כרומוזומלי H2B מפעיל את התגובה החיסונית בסוגי תאים שונים, הפועל כחיישן ציטוזולי לזיהוי שברי DNA דו-גדילי (dsDNA) שמקורם בחומרים זיהומיים או תאים פגומים54.בנוכחות נגיפי DNA, דלדול H2B עיכב ייצור IFN-β וזרחון STAT154.ידוע גם כי H2B נע פנימה והחוצה מהגרעין מהר יותר מהיסטוני ליבה אחרים54.אינטראקציות H2B עם MDN1 ו-LRCH4 נצפו גם בדגימות נבחרות לא מטופלות.מצאנו ש-HLA-A קיים אינטראקציה עם H2B בכל שלוש הדגימות שטופלו ב-IFNα ובדגימה חוזרת אחת שלא טופלה.נתונים אלה משקפים את התפקיד של H2B בתפקוד פיזיולוגי חלופי ללא תלות בוויסות התעתיק.
HMGA1 (קבוצת ניידות גבוהה AT-Hook 1), נוקלאופרוטאין קטן העשיר בחומצות אמינו מקדמות מחלות, זוהה בקשר עם HLA-A.יש לו זנב חומצי C-terminal ושלושה DBDs ברורים הנקראים AT hooks מכיוון שהם נקשרים לחריץ הקטן של האזור העשיר ב-AT ב-dsDNA55,56.קישור זה גורם ל-DNA להתכופף או להתיישר, מה שמאפשר לגורמי שעתוק קנוניים לגשת לרצף הקונצנזוס שלו.מאמינים שהזנב C-טרמינלי מעורב באינטראקציות חלבון-חלבון ובגיוס של גורמי שעתוק, מכיוון שמוטנטים של מחיקה C-טרמינליים אינם מסוגלים ליזום שעתוק57.יתר על כן, תחום זה מכיל מספר אתרי זרחון משומרים שהם מצעים ידועים לקינאזות 58.ראינו אינטראקציות של HLA-A ו-H2B עם HMGA1 מחוץ לתחום ה-C-טרמינלי, מה שמצביע על כך שהתחום ה-C-טרמינלי משמש בעיקר לקשירת גורם שעתוק (איור 5A, C).חלבוני HMGA מתחרים עם היסטון H1 על קישור ל-DNA מתאם, ובכך מגדילים את הנגישות57.באופן דומה, סביר להניח ש-HMGA מקיים אינטראקציה עם היסטון H2B לאורך ה-DNA המקשר בתחרות עם היסטון H1.HMGB1 גורם לביטוי של HLA-A, -B ו-C בתאים דנדריטים, מה שמוביל להפעלתם59, אך אינטראקציה בין HMG ל-HLA לא דווחה בעבר.מצאנו ש-HMGA1 מקיים אינטראקציה עם תחומי α1 ו- α3 של HLA-A, כאשר רוב האינטראקציות מחוץ ל-3 DBD שלו (איור 5A,C).בידינו, נמצא כי HLA-A היה מקומי בגרעין (נתונים לא מוצגים), ובהתחשב בכך ש-H2B ו-HMGA1 נמצאים גם בגרעין, סביר להניח שאינטראקציה זו מתרחשת בגרעין.תוספות ספציפיות שנמדדו בין H2B, HLA-A ו-HMGA1 מוצגות באיור 5D.
רוב האינטראקציות של HLA-A עם חלבונים אחרים מתרחשות בתחומי α1 ו-α2 שלו ובתחום ה-C-טרמינלי הפרוע (איור 6).באחת הדוגמאות הללו, מצאנו ש-HLA-A יוצר אינטראקציה עם הזנב ה-N-טרמינלי הלא מסודר של LRCH4 (איור 6A,D).LRCH4 מווסת את הפעלת TLR4 ואת השראת ציטוקינים של LPS, ובכך מווסת את התגובה החיסונית המולדת60,61.זהו חלבון ממברנה עם תשעה חזרות עשירות בלוצין (LRRs) ומוטיב הומולוגיה של קלמודולין (CH) באקטודומיין שלו, ואחריו תחום טרנסממברני (TMD) 60, 62.דומיינים של CH דווחו כמתווכים אינטראקציות חלבון-חלבון 60 .קטע של כ-300 חומצות אמינו בין תחומי LRR ו-CH נגיש יחסית אך לא מסודר.בהתבסס על תפקודם של אזורים מופרעים כמתווכים של רשתות חלבון-חלבון ותחבורה שלפוחית ​​63, מצאנו שרוב אינטראקציות החלבון מתרחשות באזורים מופרעים.אינטראקציות עם MDN1 התפזרו לכל אורך החלבון, כולל תחומי LRR1, LRR6, CH ואזורים אקראיים, בעוד H2B נקשר בעיקר לתחום CH (איור 6A, B).יש לציין שאף אחת מהאינטראקציות לא כללה את ה-TMJ, מה שמרמז על הספציפיות של גישת CLMS (איור 6A, B).
MDN1 זוהה גם כחלק מרשת החלבון HLA-A (איור 6A).הוא שייך למשפחת חלבוני AAA (ATPases הקשורים לפעילויות שונות).זהו אותו תחום N-טרמינלי AAA שמתארגן לטבעת הקסאמרית ומסיר את גורם ההרכבה מתת-היחידה הריבוזומלית 60S 64.נראה דומה ל-dynein64,65,66.בנוסף, האזור העשיר ב- Asp/Glu עוקב אחריו תחום MIDAS (אתר תלוי יוני מתכת).בשל גודלו הגדול של MDN1 (כ-5600 חומצות אמינו) וההומולוגיה המוגבלת שלו עם חלבונים שנחקרו היטב, מעט ידוע על המבנה והתפקוד שלו בבני אדם.זיהינו את HLA-A, H2B ו-LRCH4 כשותפים לקישור MDN1 וחשפנו את הכיוון שלהם כמתחמי חלבון ב- PyMol (איור 6A,B).שלושת החלבונים הללו מקיימים אינטראקציה עם תחום AAA, תחום הקישור דמוי ה-dynein, ואולי עם תחום MIDAS MDN1.בדוח קודם, טיהור זיקה של חלבוני פיתיון זיהה את MDN1 כחלבון הקשור להיסטון H2B67.בנוסף, מחקר שנערך לאחרונה דיווח גם על אינטראקציה בין MDN ל-HLA-B בתאי HCT116 באמצעות ספקטרומטריית מסה מטוהרת זיקה, התומך בממצאים שלנו68.הזיהוי של קומפלקס זה בדגימות שטופלו ב-IFNα מצביע על תפקיד של MDN1 באיתות אינטרפרון.
מכיוון שגנים של HLA הם פולימורפיים מאוד, חילצנו קריאות רצף מיפוי HLA-A, -B ו-C מנתוני רצף RNA של תאי Flo-1 (נתונים לא מוצגים).רצפי פפטידים התואמים את קריאת הרצף חשפו הבדלים משמעותיים בין HLA-A, -B ו-C באזורים שבהם נמצאו פפטידים מקושרים ב-HLA-A (איור S3).בנוסף, לא צפינו בהצלבה בין חלבון לחלבון של מולקולות HLA-B/C עם חלבוני H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.זה מצביע על כך שאינטראקציית החלבון שנמצאה בין HLA-A, MDN1, LRCH1 ו-HMGA1 היא ספציפית ל-HLA-A.בנוסף, ניתוח פרוטאומי של דגימות לא מקושרות (טבלה S4) הראה של-HLA-A יש כיסוי רצף גבוה יותר בהשוואה ל-HLA-B או HLA-C.הפפטידים שזוהו עבור HLA-A היו בעוצמה גבוהה הן בדגימות שטופלו ב-IFNα והן בדגימות שלא טופלו.
כדי להבטיח שהאינטראקציות שזוהו כאן לא נבעו מחיבור צולב לא-ספציפי של שני חלבונים בסמיכות מרחבית, אישרנו עוד שני גורמי אינטראקציה חדשים של HLA-A על ידי ביצוע מבחני חיסון משולבים.אינטראקציות HLA-A עם MDN1 ו-H2B אנדוגניים זוהו בתאי Flo-1 שטופלו ב-IFNα וגם בתאי Flo-1 שלא טופלו (איור 7, איור S4).אישרנו ש-HLA-A נלכד על-ידי H2B במשקעים החיסוניים ושהקשר הזה נובע מטיפול ב-IFNα מכיוון ש-HLA-A נעדר בדגימות האימונו-משקעים מתאים לא מטופלים (איור 7A).עם זאת, הנתונים שלנו מצביעים על כך ש-IFNα מווסת באופן דיפרנציאלי את קישור HLA-A ל-H2B ו-MDN1.IFNα משרה קשר בין H2B ל-HLA-A, אך מפחית את הקשר שלו עם MDN1.מצאנו ש-MDN1 היה קשור ל-HLA-A בבקרות, והוספת IFNα הפחיתה אינטראקציה זו ללא תלות בהשראת MDN1 על ידי IFNα (איור 7B,C).בנוסף, חיסוני HLA-A תפס H2B בתאי A549 (איור S4), מה שמרמז על כך שאינטראקציה זו אינה תלויה בסוג התא.יחד, תוצאות אלו תומכות באינטראקציות בתיווך אינטרפרון של HLA-A עם H2B ו-MDN1.
HLA-A מטהר יחד את H2B ו-MDN1.אימונובלוטים אנדוגניים מייצגים של H2B (A) ו-MDN1 (B) חולקו מתאי Flo-1 שטופלו ב-IFNα ונבדקו עבור הנוגדנים המצוינים.IgG של עכבר וארנב שימשו כביקורת שלילית.(ג) כמויות יחסיות (קלט) של אנטיגנים שונים מתוארות על ידי אימונובלוטים שנבדקו נגד נוגדנים מסומנים, β-אקטין שימש כבקרת טעינה.
המאפיינים המבניים של אחת מהרשתות המושרות על ידי אינטרפרון, האמינות ביותר, H2B-HLA-A-HMGA1, נחקרו.השתמשנו במודל דינמיקה מולקולרית כגישה חלופית להבנת הדינמיקה הקונפורמטיבית של החלבונים המעורבים במתחם זה (איור 8).מסקנות מנתוני CLMS מצביעות על אפשרות של קונפורמציות שונות של חלבוני H2B, HLA-A ו-HMGA1.לכן, הקומפלקסים הפוטנציאליים הבאים עוצבו במדיום ממס: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A ו-H2B-HLA-A-HMGA1.מסך עגינה ראשוני של חלבון-חלבון באמצעות חבילת MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., מונטריאול, קוויבק, קנדה) הציע קונפורמציות אפשריות השונות בין חלבונים אלה (איור 8A).הדמיה של קומפלקס חלבון העגינה חשפה מספר אינטראקציות וקונפורמציות אפשריות (איור 5A, 8).לפיכך, קונפורמציה אפשרית אחת מוצגת באיור 8A (עם קישורים צולבים מסומנים) והיא הוערכה נוספת באמצעות צינור המודלים של MD.בנוסף, קישור של H2B או HMGA1 ל-HLA-A מדגיש את הזיקה הגבוהה יותר של H2B ל-HLA-A (איור 8A).
דינמיקה קונפורמטיבית של רשתות אפשריות בין מתחמי H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A ו-H2B-HLA-A-HMGA1.(א) הלוח השמאלי הוא מפה דו-ממדית (נוצרת בתוכנת SIM-XL) של קישורי צולבות תוך-מולקולריים (אדומים) ואינטרמולקולריים (כחולים) (ניתוק הצלבה מוגדר ל-3.5).בנוסף, שאריות מצולבות שזוהו מסומנות על המבנים של חלבוני H2B, HLA-A ו-HMGA1.הקונפורמציות הקשורות לחלבונים אלה חולצו באמצעות צינור העגינה המיושם בחבילת MOE.הלוח השמאלי התחתון מציג את הקונפורמציות האפשריות השונות של קומפלקסים H2B-HLA-A ו-HMGA1-HLA-A עם זיקה שונה של קשירת חלבון לחלבון (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(ב) סטיית תקן (RMSD) של עמדות אטומיות (למעט אטומי מימן) עבור כל מבנה חלבון.(ג) אינטראקציות בין חלבון-חלבון קשרי מימן ממתחמים מדומים שונים בהתחשב באינטראקציות ספציפיות באורך ≥ 10 ns.מרחק החיתוך תורם-מקבל H-bond נקבע ל-3.5 Å, וזווית החיתוך של תורם-H-מקובל נקבעה ל-≥ 160°-180°.(ד) שאריות מתויגות היוצרות אינטראקציות חלבון-חלבון HLA-A עם בני זוגם, המשתרעים על פני ≥ 20 ns, המופקים ממתחמי דמה HLA-A-H2B ו-HLA-A-HMGA1.מבני חלבון מייצגים מבנה ממוצע של 100 ns MDS.(ה) אינטראקציות בין קומפלקסים HLA-A-H2B ו-HLA-A-HMGA1 בהשוואה לאינטראקציות המעקבות אחר סימולציית H2B-HLA מעל 100 ns בהתבסס על אתר האינטראקציה K או S בין שני הפפטידים.קומפלקסים /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.ערך הסף להערכת קישורים צולבים נקבע ל-3.0, ואינטראקציות ספציפיות מ-MDS שלוקח ≥ 10 ns נלקחו בחשבון.מבני חלבון הוצגו באמצעות חבילות BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב) וסביבה מולקולרית (MOE; Chemical Computing Group Inc., מונטריאול, קוויבק, קנדה).
היציבות של מולקולות HLA-A לאורך זמן (סטיית תקן; RMSD או סטיית תקן; RMSF) הצביעה על כך שנוכחות חלבוני H2B או HMGA1 בקומפלקסים ייצבה את HLA-A (איור 8B, איור S5).החלבון HMGA1 נקשר בחוזקה לאתר B2M של HLA-A, מה שגורם ליציבות של חומצות האמינו HLA-A בקומפלקס HLA-A-HMGA1 או H2B-HLA-A-HMGA1 (איור 8B, איור S5).בפרט, שאריות HLA ~60-90 ו~180-210 נמצאו כפחות גמישות בנוכחות H2B (איור 8B).H2B ו-HMGA1 הראו קישור טוב יותר ל-HLA-A בקומפלקס H2B-HLA-A-HMGA1 בהשוואה לקישור HLA-A ל-H2B או HMGA1 בלבד (איור 8C,D; טבלה S5).שאריות המעורבות בקשרי מימן (MD במודל של תפוסה גבוהה ≥ 10 ns) חופפים לאתרי אינטראקציה של CLMS (שיירי K או S) במתחם, מה שמצביע על כך שהאינטראקציות שזוהו על ידי CLMS אמינות מאוד.אמינות (איור 8E).במודלים של CLMS ו-MD, נמצאו שיירי HLA-A בין כ-190-210 וכ-200-220 חומצות אמינו כקושרות ל-H2B ול-HMGA1, בהתאמה (איור 8E).
אינטראקציות חלבון-חלבון יוצרות רשתות מבניות דינאמיות המתווכות תקשורת תוך תאית בתגובה לגירויים מסוימים.מכיוון שהרבה גישות פרוטאומיקה מזהות שינויים ברמת היציבות הכללית של חלבון, דינמיקת אינטראקציה בין חלבון לבין חלבון דורשת כלים נוספים כדי ללכוד ממשקי מקשר, ו-CLMS הוא כלי כזה.מערכת איתות האינטרפרון היא רשת ציטוקינים המאפשרת לתאים להגיב למגוון של אותות פתוגניים סביבתיים ופתולוגיים מהותיים, ששיאו בהשראת תת-קבוצות של חלבונים הניתנים להשראת אינטרפרון.השתמשנו ב-CLMS כדי לקבוע אם ניתן לזהות אינטראקציות חדשות בין חלבון לחלבון בין פאנל של חלבונים המושרים על ידי אינטרפרון.ניתוח הצלבת חלבון גלובלי במודל תאי Flo-1 המגיב לאינטרפרון שימש ללכידת קומפלקסים של חלבון.מיצוי של פפטידים טריפטיים מתאי לא מקושרים ומצולבים מאפשר ספירת פפטידים, העשרת מסלול ופיזור אורך פפטידים בעוצמת LFQ מוגדרת.חלבונים קנוניים הניתנים להשראת אינטרפרון זוהו כבקרה פנימית חיובית, בעוד שנצפו אדדוקטים מוצלבים בין מולקולריים ובתוך מולקולריים של חלבונים קנוניים הניתנים להשראת אינטרפרון כגון MX1, UP18, OAS3 ו-STAT1.מאפיינים מבניים ואינטראקציות שונות בתחומים תפקודיים נחקרו.
אינטראקציה בין HLA-A, MDN1 ו-H2B זוהתה על ידי אימונובלוטינג בתאי Flo-1 ו-A549 שטופלו ולא טופלו ב-IFNα.התוצאות שלנו מדגישות כי HLA-A מורכב עם H2B באופן תלוי IFNα.העבודה שלנו מייצגת שדרה מעניינת לחקירה נוספת של הלוקליזציה המשותפת של שני המתחמים הללו.זה יהיה גם מעניין להרחיב את גישת CLMS לפאנל של שורות תאים כדי לזהות אינטראקציות חלבון בתיווך אינטרפרון עצמאיות מסוג תא.לבסוף, השתמשנו במודלים של MD כגישה חלופית להבנת הדינמיקה הקונפורמטיבית של חלבונים המעורבים בקומפלקס H2BFS-HLA-A-HMGA1, שעקב אחר דיבורים תוך מולקולריים ואינטרמולקולריים.מסקנות מנתוני CLMS מצביעות על אפשרות של קונפורמציות שונות של חלבוני H2BFS, HLA-A ו-HMGA1.הקונפורמציות השונות האפשריות בין מתחמי חלבון העגינה הללו חשפו מספר אינטראקציות דומות לאלו שנצפו במערך הנתונים של CLMS.אחת החוזקות העיקריות של השיטה שלנו היא שהיא מאפשרת זיהוי קל של גנים בעלי אינטראקציה פולימורפית מאוד כגון HLA, כך שיהיה מעניין לחקור אינטראקציות של חלבונים ספציפיים להפלוטיפ HLA שקשה לחקור אחרת.ביחד, הנתונים שלנו מוכיחים שניתן להשתמש ב-CLMS כדי להרחיב את ההבנה שלנו לגבי רשתות איתות הנגרמות על ידי אינטרפרון ולספק בסיס לחקר מערכות בין-תאיות מורכבות יותר במיקרו-סביבת הגידול.
תאי Flo-1 התקבלו מ-ATCC ונשמרו ב-DMEM (Gibco) בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין (Invitrogen), 10% סרום בקר עוברי (Gibco) ואוחסנו ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.דְגִירָה.תאים גודלו ל-70-80% התכנסות לפני שטופלו ב-IFNα14 (מיוצר על ידי מתקן ייצור חלבון אדינבורו).כל הכימיקלים והריאגנטים האחרים נרכשו מ-Sigma Aldrich אלא אם צוין אחרת.
תאי Flo-1 תורבו בצלחות 6-בארות ולמחרת התאים טופלו ב-10 ננוגרם/מ"ל IFNα14 למשך 24 שעות עד לכ-80% מפגש.תאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS וקשרו עם DSS שהוכן טרי (Thermo Fisher Scientific) (מומס ב-DMSO) ב-PBS למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס לריכוז סופי של 0.5 מ"מ.תגובת ההצלבה של DSS הוחלפה ב-PBS ושארית DSS הופסקה על ידי הוספת 20 mM Tris (pH 8.0) ב-PBS למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.תאים נאספו על ידי גרידה ונאספו בצינורות חיבור נמוכים (Axygen).
גלולת התא עברה ליטוש עם 300 μl של חיץ תמוגה של אוריאה (8 M אוריאה, 0.1 M Tris, pH 8.5) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור מדי פעם.כל שלבי הצנטריפוגה בוצעו ב-14,000 xg ב-8 מעלות צלזיוס.צנטריפו את ה-lysate למשך 10 דקות והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש.החלקיקים הצלולים הנותרים הומסו ב-150 μl של חיץ התמוגה השני (2 M אוריאה, 2% (w/v) SDS (נתרן דודציל סולפט)) למשך 30 דקות או יותר עד לקבלת תמיסה מימית הומוגנית.ה-lysate עבר צנטריפוגה למשך 20 דקות והסופרנטנט מעורבב עם ה-lysate שהושג בשלב הקודם.ריכוזי החלבון הוערכו באמצעות מבחן Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) בהתאם להוראות היצרן להליכי מיקרופליט.הדגימות הוקפאו במהירות בחנקן נוזלי ואוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס.
כ-100 מיקרוגרם של חלבון צולב מסיס עובד באמצעות פרוטוקול הכנת דגימת סינון שונה (FASP) כפי שתואר על ידי Wisniewski וחב'.69 בקצרה, החלבון מקושר עם 200 μl של חיץ אוריאה (8 M אוריאה ב-0.1 M Tris, pH 8.5), מערבולת ומחצה לחצי.כל שלבי הצנטריפוגה בוצעו ב-14,000 xg ב-25 מעלות צלזיוס.המחצית הראשונה של הליזאט החלבון המצולב הועברה למכשיר סינון צנטריפוגלי של 10 kDa Microcon המצויד בממברנה Ultracel-10 (Merck), ולאחר מכן צנטריפוגה על המסנן למשך 25 דקות.לאחר מכן הוסף את החצי השני של החלבון למסנן וחזור על אותם שלבים.שחזור חלבון בוצע על ידי הוספת 100 μl של 17 mM tris(2-carboxyethyl)phosphin hydrochloride (TCEP) במאגר אוריאה.ההתאוששות בוחשה על מיקסר תרמו ב-600 סל"ד למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.בנוסף, העמודה עברה צנטריפוגה והחלבון המוצלב המופחת עבר אלקילציה באמצעות 100 μl של 50 mM iodoacetamide במאגר אוריאה.תגובת האלקילציה בוצעה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות בחושך.סובב את העמודה, שטפו את קירות העמודה 3 פעמים עם חיץ של 100 μl אוריאה, ולאחר מכן צנטריפוגה.אותה פעולה בוצעה 3 פעמים באמצעות 100 μl של 100 mM אמוניום ביקרבונט.לפני הטריפסיניזציה, החלף את צינור האיסוף בחדש.הוסף חיץ עיכול המכיל 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט ו-1 μl טריפסין מדולל במאגר טריפסין (פרומגה).היחס בין טריפסין לחלבון נשמר על 1:33 בערך, ותגובות עיכול הודגרו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בתא לח.הפפטיד המוצלב נחלץ מהמסנן בצנטריפוגה למשך 25 דקות.התאוששות הפפטידים שופרה על ידי הוספת 50 μl של 0.5 M NaCl למסנן, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 25 דקות.
עמודות C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) שימשו להמלחת פפטידים טריפטיים מקושרים בהתאם לפרוטוקול המתואר על ידי Buchal et al.70 עם שינויים קלים.בקצרה, עמודות ספין C18 הופעלו עם שלוש שטיפות של 0.1% חומצה פורמית (FA) באצטוניטריל (AcN) (Merck) ושתי שטיפות של 0.1% FA.העמודה הולחמה עם 0.1% FA למשך 15 דקות.טען דגימות לעמודות ספין ושטוף 3 פעמים עם 0.1% FA.הפפטידים המותחים נפלטו ברצף עם שיפוע צעדי באמצעות 50%, 80% ו-100% AcN ב-0.1% FA.הדגימות יובשו ברכז SpeedVac Plus (Eppendorf) עד שהנוזל שיורי נעלם לחלוטין.הפפטידים שנפלטו הומסו ב-100 μl של חומצה טריפלואורית 0.08% ב-2.5% AcN והריכוזים נמדדו על NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).כ-1 מיקרוגרם של פפטיד מוצלב לדגימה הוזרק למערכת LC-MS/MS.
פפטידים מקושרים הופרדו על מערכת UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) המחוברת לספקטרומטר מסה Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).פפטידים מקושרים נאספו על עמודת לכידת C18 באורך 300 מיקרומטר, באורך 5 מ"מ של מיקרומטר טרום-עמודה, עמוסה בחומר סופג C18 PepMap100 וסופח PepMap של 5 מיקרון (Thermo Scientific).טען את זרימת המשאבה ב-5 μl/דקה 0.08% חומצה טריפלואורית מומסת ב-2.5% AcN.פפטידים מצולבים הופרדו על עמודת סיליקה מאוחדת אנליטית בקוטר פנימי של 75 מיקרומטר ואורך של 150 מ"מ, מלאה בחומר סופח של 2 מיקרומטר PepMap (Thermo Scientific).שלבים ניידים A ו-B כללו 0.1% FA במים ו-0.1% FA באצטוניטריל, בהתאמה.השיפוע מתחיל ב-2.5% B ועולה באופן ליניארי ל-40% B במשך 90 דקות, ולאחר מכן ל-90% B במהלך 2 הדקות הבאות.הרכב הפאזה הנייד נשמר ב-90% B למשך 10 דקות ולאחר מכן ירד באופן ליניארי ל-2.5% B במשך 2 דקות.העמודה עברה איזון ב-2.5% B במשך 8 דקות לפני המחזור הבא.פפטידים מקושרים שנפלטו מהעמודה האנליטית יוננו במקור יינון ננו-אלקטרו-ספריי (NSI) והוחדרו לתוך ספקטרומטר מסה Exploris 480 (Thermo Scientific).
ספקטרומטר המסה Orbitrap Exploris 480 פעל במצב מתאם נתונים חיובי.סריקה מלאה בוצעה במצב מקטע ברזולוציה של 120,000 עם הגדרות טווח מ-m/z 350 Th ל-m/z 2000 Th.יעד ה-AGC המנורמל נקבע ל-300% עם זמן קלט מקסימלי של 50ms.זיהוי שיא מונואיזוטופי הוקם עבור פפטידים.פרמטר הרפיית האילוץ מוגדר כ-true אם נמצאו מעט מדי מבשרים.חוזק יוני המינימלי של המבשר נקבע ל-5.0e3 ומצבי מטען מבשר עד +8 נכללו בניסויים.
זמן המחזור בין סריקות גדולות במצב מתאם נתונים נקבע ל-2.5 שניות.הדרת מסה דינמית נקבעה ל-20 שניות לאחר הפיצול הראשון של היון המבשר.חלון הבידוד המבשר הוגדר ל-2 Th.סוג אנרגיית ההתנגשות המנורמלת עם מצב אנרגית התנגשות קבוע נבחר בסריקת MS/MS תלוית נתונים.אנרגיית התנגשות מוגדרת ל-30%.רזולוציית Orbitrap נקבעה ל-15,000 ויעד AGC ל-100%.זמן ההזרקה המקסימלי המותאם אישית מוגדר ל-60 מילישניות.
לפני מעקב אחר רשת החלבון-חלבון בדגימות מוצלבות, עיבדנו את הקבצים הגולמיים באמצעות חבילת MaxQuant (גרסה 1.6.12.0)26,27 כדי לזהות פפטידים/חלבונים שניתנים למעקב בדגימות.בנוסף, בוצעו ניתוחים פרוטאומיים דומים על דגימות Flo-1 שאינן צולבות שטופלו ולא טופלו ב-IFNα.נתוני MS/MS בוצעו חיפוש במסד הנתונים האנושי של UniProt (www.uniprot.org) (הועלה ב-12 באוגוסט 2020, מכיל 75,093 ערכים) באמצעות מנוע החיפוש המובנה Andromeda27.החיפוש בוצע מבלי לציין את הספציפיות של האנזים ושינויים שונים של דאמידציה (N, Q) וחמצון (M).סובלנות מסה מקדים נקבעו ל-20 ppm ויוני המוצר ב-0.02 Da.סטיית המסה הראשונית והמקסימלית נקבעה ל-10 ppm.המסה המקסימלית של הפפטיד נקבעה ל-4600 Da ודמיון הרצף נקבע בין 7 ל-25 חומצות אמינו (aa).ניתוח סטטיסטי נוסף בוצע באמצעות תוכנת Perseus (גרסה 1.6.10.45).תכולת החלבון חושבה על ידי נרמול העוצמה הספקטרלית של החלבון (עוצמת LFQ; כימות ללא תווית)27 וערכי העוצמה הומרו ל-Log2.מקבץ היררכי של חלבונים שזוהו על ידי עוצמת הפפטידים שלהם נבנה באמצעות חבילת ה-pheatmap (v1.0.12) ב-R (v 4.1.2).ניתוח העשרת מסלולים בוצע באמצעות מסד הנתונים של מסלולי Reactome עבור חלבונים שטופלו ב-IFNα שהופעלו יותר מפי ארבע בהשוואה לדגימות לא מטופלות.
זיהוי של קישורים כימיים ספציפיים לליזין (K) או סרין (S) של קומפלקסים חלבונים המנוטרים על ידי LC-MS/MS בוצע באמצעות מכונת זיהוי ספקטרוסקופית (SIM-XL) לפפטידים צולבים (SIM-XL)29.ראשית, אינטראקציות אפשריות בין גנים הקשורים לאינטרפרון (IFN) DNA חתימת עמידות בפני נזק (IRDS) נחקרו באמצעות מערך החלבון IRDS המתואר ב- Padariya et al.28.הקרנה של כל התנאים והחזרות של ה-UniProt האנושי כולו היא אינטנסיבית מבחינה חישובית, ולכן כל מסד הנתונים של UniProt האנושי (www.uniprot.org) (הורד ב-12 באוגוסט 2020, מכיל 75,093 ערכים) כנגד חזרות שטופלו ב-IFNα.אחד המסננים לאינטראקציות אמון גבוהות.אינטראקציות אלה בעלות מובהקות גבוהה שהתקבלו הורחבו ונבדקו בכל החזרות והתנאים.
ב-SIM-XL, נעשה שימוש ב-DSS עבור ה-crosslinker (XL) והסטת משקל XL ושינוי משקל הוגדרו ל-138.06 ו-156.07, בהתאמה.אתרי תגובת ההצלבה הבאים נחשבים: KK, KS ו-KN-TERM, ללא יוני מדווח.הן קדם והן fragment ppm נקבעו ל-20 וסף Xrea נקבע ל-0.15.טריפסין נחשב לספציפי לחלוטין, ויושמה שיטת פיצול C-trap באנרגיה גבוהה (HCD).סף הפחתת ה-DB הדינמי של XCorr והמספר המינימלי של פפטידים להפחתת DB דינמי נקבעו ל-2.5 ו-2, בהתאמה.פרמטרים נוספים הם: הסתברות מונואיזוטופ וחיתוך שיא צירוף מקרים, מינימום 4 שאריות AA לכל גדיל ומטען גדיל מקסימלי, ו-3 מקסימום של פיצולים שהוחמצו.המפות התפורות הדו-ממדיות שהתקבלו נותחו ב-(SIM-XL) והייצוג הגרפי של xQuest28 שימש לבניית המפות הדו-ממדיות.קישורי חלבון צולבים על מבני חלבון מסופקים ב-PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, גרסה 2.0 Schrödinger, LLC).
מבני מודל חלבון נוצרו באמצעות שרת Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 תוך שימוש בעקרונות של מידול הומולוגיה ויישום של "שיטת המרקוב הנסתרת".Phyre2 מייצר מבני מודל המבוססים על יישור רצף עם מבני חלבון ידועים.עבור חלבוני H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 ו-MDN1, נעשה שימוש במבני תבנית 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 ו-6i2665.בנוסף, נשקל גם המבנה של AlphaFold71 MX1, UBP18 ו-ROBO1.מבנה החלבון הוצג באמצעות חבילת BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב) וחבילת הסביבה המולקולרית (MOE; Chemical Computing Group Inc., מונטריאול, קוויבק, קנדה).